利用CRISPR/Cas9 系统构建HMGA2 敲除肝癌细胞株及其功能鉴定

徐 涛顾 鹏陈傍柱叶 行梁春锦张映辉顾为望

(1.南方医科大学实验动物管理中心暨比较医学研究所,广州 510515; 2.东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司,广东东莞 523808; 3.五邑大学生物科技与大健康学院,广东江门 529020)

高迁移率蛋白A2(high-mobility group AT-hook 2,HMGA2)属于高迁移率蛋白超家族成员,是一种非组蛋白染色质结合蛋白,主要包括三个AT-hook区以及一个酸性C 末端[1]。 AT-hook 区可以高亲和力的结合到基因组中AT 富集区域,这些区域一般都是相关基因表达调控元件,从而调控靶基因的表达。HMGA2 基因位于12 号染色体长臂,由5 个外显子构成。 HMGA2 一般在胚胎发育早期以及未分化的细胞中高表达,而在成体正常细胞或高度分化的细胞中基本不表达或表达量很低[2]。 但是,研究发现在肺癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]、结直肠癌[6]等肿瘤组织中HMGA2 的表达均显著升高,提示HMGA2可能是一个致癌基因,可以作为癌症早期诊断的潜在分子靶标[7]。 HMGA2 的异常表达通常与肿瘤发生相关,它主要影响肿瘤细胞的增殖、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、转移以及肿瘤组织内的微血管生成等过程[8-9]。

肝癌作为一种常见肿瘤,其发病率与致死率均在各种肿瘤中名列前茅,而且肝癌细胞转移性强[10]、对常规化疗药物耐受性较强[11]、预后较差等特点进一步加剧了治疗难度。 因此,筛选肝癌治疗的潜在分子靶点,对于肝癌的早期诊断、临床治疗以及预后评估具有重大意义[12]。 虽然 HMGA2 已证明在多种肿瘤中均可作为分子靶标以及预后评估的潜在分子,但HMGA2 在肝癌中的作用目前研究较少。 本研究采用CRISPR/Cas9 系统引起肝癌细胞系HepG2 中的HMGA2 基因大片段删除,进而失活该基因,建立HMGA2 敲除细胞株,并对此进行了相关功能的鉴定,探讨HMGA2 对于肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响,从而为肝癌的靶向治疗提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人肝癌细胞系HepG2 购自美国ATCC。

1.2 主要试剂

PX458 质 粒 购 自 Addgene; 高 糖 DMEM(8115247)、胎牛血清(42A0378 K)、双抗(21442)、0.25%胰蛋白酶(25200)购自Gibco;Lipofectamine®2000(2004957)、 Opti-MEM ® (1119701)、 TRIzol(15596026 ) 购自 Thermo; 反转录试剂盒(AI40826A)、荧光定量 PCR 试剂盒(AJ51622A)、细胞基因组提取试剂盒(AK2101)、Premix TaqTM酶(A191625A)、T4 连接酶(AH70103A)购自 TaKaRa;DH5α 感受态细胞(180428)与质粒小提试剂盒(S7923)购自TIANGEN;Bbs Ⅰ内切酶(00397116)、T4 PNK 磷酸化酶(10020296)购自NEB;Transwell小 室 (11919023)、 Matrigel 胶 (9119018) 购 自Corning;全蛋白提取试剂盒(20190213)购自凯基生物;HMGA2 一抗(79h6360) 及 Western blot 二抗( 12v9698 ) 购 自 Affinity、 GAPDH 一 抗( AH08191878 ) 购 自 Bioss; CCK8 试 剂 盒(EG20180126)购自南京恩晶生物。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

HepG2 细胞培养在含有10% FBS、1%青/链霉素的高糖DMEM 培养基中,于37℃、5% CO2,饱和湿度条件下培养,每隔3 d 换一次液。 取生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.3.2 sgRNA 寡核苷酸链设计

根据GenBank 中发表的HMGA2 序列信息(ID:NM_003483),利用CRISPR/Cas9 sgRNA 在线设计软件(http:/ /crispor.tefor.net/)分别在HMGA2 基因的第一外显子与第二外显子处各设计一条sgRNA,分别命名为sgE1 与sgE2(如图1),并在正义链的5′端添加CACC 接头,在反义链的5′端添加AAAC 接头,便于与酶切载体连接;此外,由于sgE2 不是以G开头,所以需在接头与sgE2 的5′端之间加上G,以提高U6 启动子的转录活性。 最终oligo 序列如表1所示。

1.3.3 重组载体PX458-sgRNA 构建

两条sgRNA 进行末端磷酸化与退火反应,反应体系为:sgRNA-T 1 μL,sgRNA-B 1 μL,T4 PNK 0.5 μL,T4 Ligase Buffer 1 μL,ddH2O 6.5 μL,37℃反应30 min 后于沸水中加热5 min,自然冷却至室温。 用T4 连接酶将退火产物与经Bbs I 酶切的PX458 质粒连接,16℃连接30 min,并将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ 中,均匀涂布于含氨苄青霉素的LB 固体平板上37℃过夜培养,挑取单克隆鉴定并由睿博兴科广州分公司采用Sanger 测序法进一步鉴定正确插入。

1.3.4 细胞转染与单克隆筛选

将状态良好的细胞铺到24 孔板中,待细胞汇合度达到80%时采用Lipo2000 将两个sgRNA 重组质粒混合转染HepG2 细胞,转染2 d 后于荧光显微镜下观测转染效率。 将细胞悬液稀释至每毫升100 个细胞,以每孔10 μL 加入96 孔板,进行单克隆筛选,待克隆长至合适大小后挑取克隆于24 孔板中,并进行敲除鉴定。

1.3.5 细胞敲除株鉴定

采用NP40 裂解细胞,程序为:56℃ 1 h,95℃ 10 min。 扩增HMGA2 基因敲除后的短序列片段,PCR引 物 序 列 为:HMGA2-F: 5′-GACGTCCGGTGTTG ATGGTG-3′,HMGA2-R: 5′-CAAATTCCTGGCTGCG GAGT-3′,扩增程序为:95℃ 3 min;94℃ 30 s,60℃30 s,72℃ 30 s,36 个循环;72℃ 2 min。 PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并送睿博兴科广州分公司进行Sanger 测序。 对经测序鉴定为可能Indel 的片段采用 pMD19-T Vector Cloning Kit 进行 TA 克隆,随机挑取10 个单克隆进行Sanger 测序,并通过BLAST 在线软件比对,鉴定敲除株基因型。

1.3.6 实时荧光定量PCR

采用TRIzol 法提取RNA,并利用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA,采用嵌合荧光法对HMGA2的表达情况进行定量分析,以GAPDH为内参。qPCR 反应条件为:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环;60℃ 2 min。 采用 2-ΔΔCt法分析基因相对表达情况。 所用引物如表2 所示。

1.3.7 蛋白表达水平检测

将对照组与敲除株细胞铺于六孔板,待细胞长至80%汇合度时,用冷的PBS 洗两遍,加入200 μL细胞裂解液于冰上裂解30 min。 4℃,12000 r/min离心5 min。 吸取上清,用BCA 法进行蛋白定量,并用5×Loading buffer 调整蛋白至适当浓度,100℃水浴 5 min。 SDS-PAGE 电泳,恒压 80 V 30 min,120 V 60 min,切下目的条带与内参条带,转PVDF 膜。 用5% BSA 室温封闭1 h,一抗4℃过夜孵育,TBST 洗膜5 min×4 次,二抗室温孵育1 h,TBST 洗膜5 min×4 次。 采用ECL 化学发光法显影。

1.3.8 CCK8 细胞增殖实验

图1 sgRNA 位点Figure 1 Locus of sgRNA

表1 sgRNA oligo 序列Table 1 Sequence of sgRNA oligo

表2 qPCR 引物Table 2 qPCR amplification primers

用0.25%胰酶消化细胞,制成单细胞悬液。 将细胞密度调整为每毫升1×104个,每孔200 μL。 加入96 孔板中,每个样品6 个重复,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养。 分别在 0 h,24 h,48 h,72 h 和96 h 每孔加入10 μL CCK8,37℃避光孵育4 h,用酶标仪测定450 nm 处吸光度。 用样品吸光度减去空白吸光度得到相对吸光度值,采用Graphpad prism 5软件绘制生长曲线。

1.3.9 克隆形成实验

用0.25%胰酶消化细胞,制成单细胞悬液,以1000 个/孔将细胞均匀铺到六孔板中,每3 d 换一次液。 待长出肉眼可见单克隆后,采用4%多聚甲醛固定细胞,1%结晶紫溶液染色,计数细胞数大于50的单克隆数量。

1.3.10 肿瘤迁移与侵袭实验

用胰酶消化细胞后,将细胞移入离心管中,1000 r/min 离心5 min,PBS 洗两遍并用无血清培养基重悬细胞,将细胞密度调整为每毫升5×105个。 对于迁移实验,每个Transwell 上室加入100 μL 细胞悬液,下室加入 600 μL 含 10% FBS 的全培,培养箱中孵育24 h;对于侵袭实验,先以1 ∶8的比例于冰上采用无血清培养基稀释Matrigel 胶,每个Transwell 上室加70 μL 稀释的 Matrigel 胶,培养箱中孵育6 h,待胶完全凝固后,下室加入600 μL 含10% FBS 的全培,培养箱中孵育30 min,向上室中轻柔加入200 μL 细胞悬液,培养箱中孵育24 h。 取出上室,PBS洗3 遍后用棉签擦去上室孔内的细胞与Matrigel胶,4%多聚甲醛固定15 min,结晶紫溶液染色10 min,在10×10 倍镜下随机选取十个视野,计数细胞数量。

1.4 统计学方法

用SPSS 24.0 进行数据处理以及统计学分析,结果以平均数±标准差(±s)表示。 组间比较采用t检验,P< 0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 PX458-sgRNA 载体鉴定

将两对sgRNA oligo 退火形成双链后连接到经Bbs I 酶切的PX458 质粒上,转化入大肠杆菌并挑取单克隆菌落,经PCR 鉴定后将阳性质粒测序。 测序结果显示两对sgRNA 均正确插入到酶切位点内(图2)。

2.2 细胞敲除株鉴定

将两对PX458-sgRNA 载体混合转染HepG2 细胞,采用有限稀释法获得单克隆细胞集落,用一对鉴定引物,采用短片段扩增程序进行PCR 鉴定,敲除株由于大片段删除可以得到400 bp 左右的片段(图3A)。 将扩增片段测序,结果显示在 sgRNA 位点处存在套峰,即插入/缺失突变(图3B)。 进一步基因型分析显示,敲除株的基因组存在大片段缺失(表3)。 对敲除株细胞进行RT-qPCR 检测,结果表明在mRNA 水平上HMGA2 的表达已有大幅度下降(P< 0.01,图3C)。 Western blot 检测显示已经完全没有HMGA2 蛋白的表达(图3D)。 综合结果可知,获得的细胞株为HMGA2-/-细胞株。

2.3 HMGA2 敲除引起细胞增殖速率的改变

采用CCK8 细胞增殖实验以及克隆形成实验检测细胞的增殖能力以及克隆形成能力。 CCK8 实验表明,HMGA2 敲除后细胞的增殖速率明显减慢(图4A);而克隆形成实验也表明HMGA2 敲除引起克隆形成能力减弱,细胞存活率降低(121.83 ± 21.68 vs 59.50 ± 20.68,P< 0.01,图4B)

2.4 HMGA2 敲除对于肿瘤细胞迁移与侵袭的影响

Transwell 迁移实验表明, 相对于野生型,HMGA2 敲除后 HepG2 的迁移能力明显减弱(359.67 ± 32.53 vs 245.61 ± 24.23,P< 0.05)(图5)。 Transwell 侵袭实验也表明HMGA2 的敲除也会导致 HepG2 细胞体外侵袭能力减弱(251.33 ±43.43 vs 47.00 ± 10.00,P< 0.01)(图5)。

图2 PX458-sgRNA 载体测序结果Figure 2 Sequencing results of PX458-sgRNA vectors

注:A:PCR 鉴定大片段删除(M:DL1000 marker);B:Sanger 测序显示在sgRNA 位点处存在插入/缺失突变;C:RT-qPCR 检测mRNA 表达水平;D:Western blot 检测HMGA2 蛋白水平表达。 与对照组比较,∗∗P < 0.01。图3 细胞敲除株鉴定结果Note.A, Larger fragment deletion was tested by RCR (M, DL 1000 marker).B, Indel in sgRNA locus was investigated by Sanger sequencing.C, Expression levels were measured by RT-qPCR.D, Western blot to analyze HMGA2 protein upon knockout HMGA2.Compared with control group, ∗∗P < 0.01.Figure 3 Identification of knockout cell line

表3 细胞株基因型Table 3 Genetypes of cell line

注:A:CCK8 实验检测细胞增殖速率;B:克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。 与对照组比较,∗∗P< 0.01。图4 HMGA2 敲除对于细胞增殖的影响Note.A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial.B, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay.Compared with control, ∗∗P < 0.01.Figure 4 Effect of proliferation in HMGA2 knockout

注:与对照组比较,∗P < 0.05,∗∗P < 0.01。图5 HMGA2 敲除对于细胞迁移与侵袭的影响Note.Compared with control, ∗P<0.05, ∗∗P < 0.01.Figure 5 Effect of HMGA2 knockout on migration and invasion

3 讨论

人类HMGA2 基因位于染色体12q15 区域,其编码的蛋白属于高迁移率蛋白家族成员,主要作为一种转录调控因子,通过蛋白-蛋白或者蛋白-DNA 互作调控靶基因的表达。 有研究表明,HMGA2 主要在胚胎早期以及肿瘤细胞中高表达,而在正常成体组织中则表达量很低或不表达,提示HMGA2 对于胚胎早期的正常发育极为重要,同时也是一个重要的致瘤因子。 Yang 等[13]发现沉默HMGA2 抑制急性髓性白血病细胞的迁移、侵袭以及生存能力,增强其凋亡速率以及对药物的敏感性。 同样的,Zhu等[14]沉默鳞状细胞癌中的HMGA2 也引起细胞中EMT 有关基因的下调,而过表达则可使癌细胞获得干细胞样特征。 对胃癌的病例研究发现,HMGA2有助于胃癌的血管生成,从而促进癌细胞的生长,此外还与肿瘤患者的预后不良有关[15]。 但是对自发性胰腺癌小鼠的研究发现,HMGA2 敲除鼠与野生型鼠在胰腺癌的发生率、对药物的敏感性以及预后等指标上并没有太大差别,表明HMGA2 作为胰腺癌的分子标记以及预后标志物还有待商榷[16]。 本研究发现在肝癌细胞系HepG2 中敲除HMGA2 后细胞的迁移与侵袭能力显著降低,表明HMGA2 也与肝癌细胞的迁移与侵袭有关。 此外,通过对原发性肝癌的病例研究也发现HMGA2 阳性患者明显预后不良[17],提示HMGA2 也可能作为评估肝癌预后的分子标记。

HMGA2 除了与细胞的迁移、侵袭以及肿瘤预后有关外,还与肿瘤细胞的增殖与抗凋亡有关。 研究表明,在急性髓性白血病细胞中,HMGA2 主要通过PI3K/Akt/mTOR 通路促进癌细胞的生长增殖,HMGA2 的敲除会引起细胞 G2/M 期阻滞[18]。 在膀胱癌中,HMGA2 抑制了 TGF-β/Smad 通路以及Wnt/β-catenin 通 路, 同 时 沉 默HMGA2 降 低 了MMP2 以及MMP9 的表达水平,提高了癌细胞的凋亡速率[9]。 与此类似,李鹏等[19]发现敲减HMGA2抑制了TGF-β1 诱导的人胚肾成纤维细胞的胶原合成,促进了ROS 的产生。 ROS 的产生则会引发细胞的凋亡反应,有助于阻止癌细胞的生长。 Wang等[20]研究发现 HMGA2 的三个 AT-hook 区可以与P53 结合,从而提高P53 泛素化水平,加快P53 蛋白的降解。 本研究通过CCK8 实验以及克隆形成实验表明,HMGA2 敲除也同样引起了HepG2 细胞的增殖速率以及克隆形成能力的显著降低,但具体的分子机制还有待进一步阐明。

综上所述,HMGA2 在多种肿瘤中均发挥了促进肿瘤细胞增殖,增强迁移与侵袭能力以及降低细胞凋亡速率等作用。 与此类似,本研究发现HMGA2在肝癌细胞 HepG2 中也发挥相似的功能,敲除HMGA2 显著抑制了HepG2 细胞的增殖速率、克隆形成能力、迁移与侵袭能力,表明HMGA2 也可能作为一个肝癌治疗的潜在分子靶标。