Sirt3 基因RNA 干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞株的构建

张静怡邓永宁张 萌屈秋民∗

(1.河南省人民医院老年医学科,郑州大学人民医院,郑州 450003;2.西安交通大学第一医院神经内科,西安 710061)

随着全球人口老龄化,衰老问题日益突出,寻找衰老相关疾病的治疗靶点成为研究的热点。Sirtuin 家族是一种线粒体NAD 依赖的去乙酰化酶,越来越多的研究发现Sirtuin 家族七个成员(Sirt1-Sirt7)与衰老相关疾病密切相关[1-2]。Sirt3 主要位于线粒体内,研究发现它通过改善线粒体功能、减轻氧化应激、增加三磷酸腺苷(ATP)生成、抑制凋亡等机制,在衰老相关的神经退行性疾病中发挥神经保护作用[3-5]。 帕金森病作为第二大神经退行性疾病,严重影响了患者的生活质量并且威胁着患者的生命,给社会增加了沉重的经济负担。 帕金森病的发病机制包括线粒体功能障碍、氧化应激等[6],所以Sirt3 在其中的作用研究受到关注。 本实验利用基因干扰RNAi(RNA interference)技术,拟构建含有RNAi 片段的慢病毒载体,抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞中Sirt3 基因的表达。 人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞具有多巴胺能神经元的特性,是帕金森病体外细胞模型中常用的细胞。 实验拟构建稳定沉默Sirt3 基因表达的细胞株,为后续研究Sirt3 在帕金森病细胞模型中的作用提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购买于美国ATCC;293T 细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂与仪器

GV248 载体、pHelper 1.0 载体,pHelper 2.0 载体购自上海吉凯基因技术有限公司;PCR 用试剂primer(R&F)、dsDNA oligo 均购自上海吉凯基因技术有限公司;质粒提取试剂盒购自QIAGEN 公司;Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen;SYBR Real-time PCR 试剂盒购自TaKaRa 公司;RNA 提取试剂盒购自飞捷生物公司;胎牛血清、胰蛋白酶、细胞培养基均购自Hyclone, USA;Western blot 制胶试剂盒购自西安先锋生物科技有限公司;β-actin 鼠抗单克隆抗体及 HRP 标记山羊抗兔 IgG(sc-2005)购买于Santa Cruz, USA;Sirt3 兔抗多克隆抗体购买于Abcams,UK;二氧化碳培养箱(Thermo Election,USA);高速台式离心机(上海市安亭科学仪器厂);PCR 仪(Applied Biosystems);生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司);荧光显微镜(Nikon, Tokyo,Japan)。

1.3 实验方法

1.3.1 RNAi 慢病毒载体的制备

(1)siRNA 的设计合成

利用RNAi 设计软件按照RNA 干扰序列设计原则,设计合成4 条针对人Sirt3 基因(GenBank:NM_004612)的siRNA 干扰序列和1 条阴性对照序列,4 条 siRNA 序 列 分 别 为: SIRT3-RNAi-1 ∶5’-ACCTGCACAGTCTGCCAAA-3’;SIRT3-RNAi-2 ∶5’-GGCTCTACACGCAGAACAT-3’;SIRT3-RNAi-3 ∶5’-CAACGTCACTCACTACTTT-3’;SIRT3-RNAi-4 ∶5’-GGGTGCTTCAAGTGTTGTT-3’。 阴性对照序列:5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。 序列由吉凯基因技术有限公司合成。 同时,用BLAST 同源性分析确认4 对干扰片段的特异性。

(2)RNAi 慢病毒载体的构建

根据以上设计的靶序列,首先合成含各干扰序列及阴性对照的单链DNA oligo(见表1),然后退火配对产生双链DNA,再通过T4 连接酶将DNA 片段与经过AgeI 和EcoRI 双酶切后的GV248 线性化载体(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)在适当的缓冲液中进行连接;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,PCR 鉴定阳性重组子,利用质粒试剂盒提取质粒,然后送DNA 测序分析进行验证。

表1 Oligo 序列Table 1 Oligo sequence

1.3.2 慢病毒载体的包装与滴度测定

(1)慢病毒载体的包装

将重组慢病毒质粒、pHelper 1.0 载体、pHelper 2.0 载体与Opti-MEM 混合均匀进行稀释,同时也将Lipofectamine 2000 试剂稀释,然后将二者进行混合,转移至293T 细胞的培养液中;转染8 h 后弃掉含有转染液的培养基,PBS 液洗后加入10%血清继续培养48 h。 收集转染后48 h 的 293T 细胞上清液,于4℃,4000 r/min 离心10 min,除去细胞碎片,以0.45 μm 滤器过滤离心后收集病毒液。

(2)慢病毒载体的滴度测定

将293T 细胞铺板;准备8 个无菌的Ep 管,在每个管中加入90 μL 的无血清培养基。 然后取待测定的病毒原液10 μL 加入到第一个管中混匀,再从中取10 μL 加到第二个管中,继续相同的操作直到最后一管进行稀释。 将细胞孔中的培养基吸去90 μL丢弃,然后加入等量稀释好的病毒溶液放入培养箱培养。 24 h 后加入完全培养基继续培养。 4 d 后观察荧光表达情况,病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。

1.3.3 慢病毒感染SH-SY5Y 细胞

复苏SH-SY5Y 细胞,将细胞分为六组:空白对照组(CON)为不加入病毒液而仅仅加入普通培养基的细胞,阴性对照组(NC)是感染阴性对照病毒的细胞、LV-Sirt3-RNAi-1 组、LV-Sirt3-RNAi-2 组、LVSirt3-RNAi-3 组、LV-Sirt3-RNAi-4 组是分别感染了LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒的细胞。 将细胞铺于六孔板中进行培养,提前进行慢病毒转染的预实验确定好MOI 值,从而据此计算加入病毒液的量。 感染3 d后在荧光显微镜下观察细胞内荧光表达情况,若80%细胞均表达荧光则表明慢病毒感染成功。

1.3.4 Real-time PCR

收集以上6 组 SH-SY5Y 细胞,按照 RNA 提取试剂盒操作流程提取总RNA,并测定RNA 浓度。将提取的RNA 与试剂盒中的试剂配成反应液,按照37℃、15 min,85℃、5 s,4℃反应条件进行反转录反应,然后将反转录液按照操作流程进行Real-time PCR 反应。Sirt3 引物:上游引物:5’-TCCTCCTTCC TAGCATCACA-3’, 下 游 引 物 5’-ATCATAACACC GCACTCCA-3’,以 GAPDH 为内参,上游引物为:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游引物为:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’。 采用 2-ΔΔCt法计算Sirt3 RNA 表达水平。

1.3.5 Western blot

收集以上6 组细胞,配取裂解液裂解细胞提取蛋白,然后用BCA 法测定蛋白浓度;按照Western blot 说明书、根据目的蛋白分子量制胶,然后在胶中加入蛋白液上样,进行SDS-PAGE 电泳,电泳结束后将蛋白转移到PVDF 膜上。 将 PVDF 膜放在PBST缓冲液中漂洗后立即用5%脱脂牛奶的封闭2 h,然后用一抗(Sirt3、内参β-actin)、二抗进行孵育。 PBS液充分洗膜后发光成像。

1.3.6 确定嘌呤霉素筛选最佳浓度及获得稳定表达细胞株

将SH-SY5Y 细胞铺板培养24 h,吸取各孔中的细胞培养基,依次加入嘌呤霉素浓度为 0、2、4、6、8、10 μg/μL 的新鲜无血清的培养基。 每天在镜下观察细胞生长状况,3 ～5 d 后能够使几乎所有细胞死亡的最小嘌呤霉素浓度即为最佳浓度。 应用慢病毒感染后的SH-SY5Y 细胞中加入确定浓度的嘌呤霉素培养基继续培养可以得到稳定表达细胞株。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计软件录入和分析数据。 实验均重复三次,得到的计量资料以平均数±标准差(±s)表示,计量资料间进行比较采用方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干扰 Sirt3 表达的 siRNA 成功插入慢病毒载体

对重组干扰慢病毒阳性克隆进行DNA 测序,结果显示:插入的针对Sirt3 基因的siRNA 核苷酸序列正确,即构建的干扰Sirt3 基因表达的4 种siRNA 重组慢病毒干扰载体的DNA 序列与设计的序列完全相符,结果表明成功构建了4 个沉默Sirt3 基因的慢病毒载体。 (见图1、2、3、4)

2.2 慢病毒载体成功转染进293T 细胞

重组慢病毒质粒与2 种包装质粒共转染293T细胞,转染后第2 天在倒置荧光显微镜下观察,可以看到细胞内发出绿色荧光(见图5),收集浓缩病毒液测定病毒滴度,根据荧光细胞数计算病毒的滴度为: LV-SIRT3-RNAi-1 8 × 108TU/mL、 LV-SIRT3-RNAi-2 3×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-3 8×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-4 8×108TU/mL。 这表明慢病毒载体成功转染进293T 细胞,成功包装的慢病毒载体可以用于后续的研究。

图1 SIRT3-RNAi-1 慢病毒载体测序结果Figure 1 Sequencing result of SIRT3-RNAi-1 lentiviral vetor

图2 SIRT3-RNAi-2 慢病毒载体测序结果Figure 2 Sequencing result of SIRT3-RNAi-2 lentiviral vetor

图3 SIRT3-RNAi-3 慢病毒载体测序结果Figure 3 Sequencing result of SIRT3-RNAi-3 lentiviral vetor

图4 SIRT3-RNAi-4 慢病毒载体测序结果Figure 4 Sequencing result of SIRT3-RNAi-4 lentiviral vetor

图5 慢病毒载体共转染293T 细胞24 hFigure 5 Lentiviral vectors were co-transfected into the 293T cells for 24 h

2.3 LV-Sirt3-RNAi-3 显著抑制 Sirt3 mRNA 表达

慢病毒感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞,实验分为六组。 Real-time PCR 方法检测六组SH-SY5Y细胞中Sirt3 mRNA 表达量分别是:CON (1.0854±0.0944),NC(1.1706±0.0167),LV-Sirt3-RNAi-1 组(1.0875 ± 0.0156), LV-Sirt3-RNAi-2 组 (1.3492 ±0.0697),LV-Sirt3-RNAi-3 组(0.2630±0.0184),LVSirt3-RNAi-4 组(1.2490±0.0049)。 统计学分析显示,LV-Sirt3-RNAi-3 组的 SH-SY5Y 细胞中Sirt3 mRNA表达量显著低于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。 (见图6)

2.4 LV-Sirt3-RNAi-3 显著抑制Sirt3 蛋白表达

六组 SH-SY5Y 细胞中 Sirt3 蛋白表达量分别是:CON 组 (0.4038 ± 0.0355),NC 组 (0.4638 ±0.0411),LV-Sirt3-RNAi-1 组(0.4533±0.0750),LVSirt3-RNAi-2 组(0.5491±0.0683),LV-Sirt3-RNAi-3组(0.1633±0.0132),LV-Sirt3-RNAi-4 组(0.5167±0.0416)。 统计学分析结果提示LV-Sirt3-RNAi-3 组的SH-SY5Y 细胞中Sirt3 蛋白表达量显著低于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。 (见图7)

注:CON 组代表没有感染病毒的SH-SY5Y 细胞内Sirt3 mRNA表达量,其余五组依次代表SH-SY5Y 细胞感染阴性对照病毒(NC)、 LV-Sirt3-RNAi-1、 LV-Sirt3-RNAi-2、 LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后细胞内 Sirt3 mRNA 的表达量。 与空白对照组(CON)相比,∗P<0.001;与阴性对照组相比,#P<0.001。图6 各组慢病毒感染SH-SY5Y 细胞后Sirt3 mRNA 的表达Note.CON group bar shows Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LVSirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group, ∗P<0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 6 Sirt3 mRNA expression in different cells infected by corresponding lentivirus

2.5 LV-Sirt3-RNAi-3 转染 SH-SY5Y 细胞稳定表达绿色荧光

加入嘌呤霉素培养基培养后获得稳定表达株通过嘌呤霉素浓度确定实验,2 μg/μL 含有嘌呤霉素培养基为最佳浓度。 在LV-Sirt3-RNAi-3 组细胞中加入嘌呤霉素培养基培养后获得稳定表达株。在荧光显微镜下观察,通过可见光视野与荧光视野对比, 可见 90% 以上细胞均可见绿色荧光。(见图8)

注:左图为Western blot 代表图,β-actin 为内参;右图为Sirt3的相对表达量,CON 组代表没有感染病毒的SH-SY5Y 细胞内Sirt3 蛋白表达量,其余五组依次代表SH-SY5Y 细胞感染阴性对照病毒(NC)、LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后细胞内 Sirt3 蛋白的表达量。 与空白对照组(CON)相比,∗P<0.001;与阴性对照组相比,#P<0.001。图7 各组慢病毒感染SH-SY5Y细胞后Sirt3 蛋白表达Note.Left graph shows Western blot images, β-actin was used as a loading control.Right bar graph shows relative expression of Sirt3.CON group bar shows Sirt3 protein expression in SHSY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 protein expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LV-Sirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group,∗P < 0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 7 Sirt3 protein expression in different cells infected by corresponding lentivirus

3 讨论

Sirt3 基因定位在11 号染色体(11p15.5)上,主要存在于肾、心脏、脑、棕色脂肪等代谢活跃的组织中[7]。 早期对Sirt3 基因多态性研究发现,Sirt3 基因外显子3 上G447T 碱基颠换与老年男性长寿有着紧密联系[8]。 也有研究发现通过节食(热量限制) 延缓动物衰老进程的机制可能是激活了Sirt3[9]。 后来的大量针对Sirt3 的生物功能研究,证实了Sirt3 作为一种去乙酰化酶,可以通过去乙酰化长链乙酰脱氢酶( LCAD)、 AceCS2 ( acetyl-CoAsynthetase II)酶、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)等调控细胞内的能量代谢平衡[10],Sirt3 还通过去乙酰化MnSOD、SOD2 等并增加其活性从而减少氧化应激损伤[11],此外Sirt3 可以减少活性氧介导的线粒体DNA 损伤[12]。 这些研究让人们意识到Sirt3 在衰老、肿瘤等疾病中的潜在作用[13]。 近年来,Sirt3 在神经退行性疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等疾病的研究中,均证实了Sirt3 的神经保护作用[14-16]。 帕金森病是老年人常见的神经系统疾病,以中脑黑质多巴胺能神经元的变性坏死及残存的神经元内出现路易小体为主要病理特点[17]。 目前对帕金森病的发病机制研究认为,主要是线粒体功能障碍、氧化应激损伤增加、α-Synuclein 蛋白的异常沉积以及三者之间的相关影响[18-20]。 在MPTP 诱导的帕金森病小鼠模型中发现,中脑组织Sirt3 的表达量减少,且Sirt3 的减少加剧了黑质纹状体多巴胺能神经元的退化[21]。 实验研究表明,褪黑激素通过上调Sirt3 表达抵抗PD多巴胺能神经元损伤,作用机制与其抑制小胶质细胞激活减轻氧化应激和炎症损伤有关[22]。 柴胡皂甙d 对MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞具有神经保护作用,且机制可能为上调Sirt3 的表达水平[23]。 另有研究发现嘌呤生物碱Theacrine 通过激活线粒体Sirt3,抑制ROS 生成,最终抑制多巴胺能神经元的凋亡[24]。 马振凯等作者实验中发现,姜黄素可降低SH-SY5Y 细胞 ROS 水平,上调Sirt3 表达[25]。 以上结果提示,Sirt3 与PD 发生具有一定的关系,但关于Sirt3 在PD 发展中具体作用分子机制的研究,还不够深入。

RNA 干扰(RNA interference,RNAi)技术,通过导入与靶基因mRNA 序列具有同源性的双链RNA,诱导同源靶基因mRNA 的降解,从而沉默该基因表达[26]。 慢病毒来源于人类免疫缺陷病毒(HIV),能感染分裂期与非分裂期细胞,还具有可容载较大基因片段、目的基因稳定持久表达、诱发宿主免疫反应率低等特点,因此慢病毒成为了携带干扰RNA 的理想载体[27]。 慢病毒载体介导的RNAi 技术,将基因干扰技术与慢病毒结合起来,特异性抑制基因的表达,现在已被广泛应用于基因工程[28-29]。 目前针对Sirt3 基因干扰及过表达的慢病毒载体构建的已有报道,但Sirt3 基因稳定干扰的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞株建立的详细方法及验证未见报道。

本实验中我们首先利用RNAi 设计软件按照RNA 干扰序列设计原则,设计合成4 条干扰序列及1 个阴性对照序列,然后将其分别与慢病毒载体连接。 通过对重组干扰慢病毒阳性克隆进行DNA 测序,结果提示插入的siRNA 核苷酸序列是正确的,表明我们成功构建了4 个沉默Sirt3 基因的慢病毒载体。 然后将重组慢病毒质粒与包装质粒共转染293T 细胞进行包装、测定滴度,从而获得了Sirt3 基因干扰慢病毒载体。 并将慢病毒载体感染 SHSY5Y 细胞,利用 Real-time PCR 及 Western blot 方法检测了Sirt3 的基因及蛋白表达情况,结果发现LVSirt3-RNAi-3 慢病毒感染组细胞内的基因表达及蛋白表达量均显著下降,因此筛选出了有效干扰序列LV-Sirt3-RNAi-3,再次说明我们成功构建了针对Sirt3 基因的RNA 干扰慢病毒载体,最终通过嘌呤霉素筛选获得稳定表达株。 实验中,其它设计的干扰载体并没有使SH-SY5Y 细胞内Sirt3 的表达明显减少,这与以往的文献报道有差别。 但我们的实验成功获得了稳定沉默Sirt3 基因的SH-SY5Y 细胞株,为后续进一步了解Sirt3 基因的生物学特性以及探讨Sirt3 引起的帕金森病细胞模型中的分子生物学变化,提供了有效的工具,具有重要的实验价值。