环境丰容对SD 大鼠行为和肾上腺皮质激素的影响研究

刘 帅宋佳阳吕 赛李军延

(中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所,北京 100050)

环境丰容(environmental enrichment)又称为环境丰富,作为提高实验动物福利的有效手段,近年来在行业内逐渐受到重视,应用也逐渐广泛[1]。 国外对此进行了大量的研究,从动物行为和生理指标两方面对环境丰容的作用进行了评估。 但不同的研究结论常常不一致[2],给我们的参考应用带来困惑。 统计发现约有70%的文献报道环境丰容提高了动物福利,10%左右的文献报道环境丰容并未达到预期效果。 差异的研究结果表明环境丰容的作用与采用的环境丰容的方式、作用时间,应用动物的品系、性别有关[3]。 而目前我国实验动物环境丰容的研究较少,行业内还没有关于环境丰富应用的行业指南或是标准,各单位都是根据自己需要进行丰富,丰富的方式和选择的材料都不统一,其实施过程多种多样,而我们对于这些应用对实验动物福利的提升及生物学指标的影响知之甚少。 因此本研究选择了市售的3 类功能8 种材料组成了不同的环境丰容方案,从行为及生理角度评价不同环境丰容的效果及对SD 大鼠的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

45 只 SPF 级雄性 SD 大鼠,6 周龄,体重 180 ～200 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 饲养于中国疾病预防控制中心动物实验室屏障环境[SYXK(京)2019-0050],饲喂60Co 灭菌大小鼠维持饲料。 饮水经反渗透紫外杀菌处理。 本研究通过了中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所实验动物管理与福利伦理审查委员会审查(EAWE-2015-007)。

1.2 主要试剂与仪器

大鼠皮质酮(CORT)酶联免疫分析试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)酶联免疫分析试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司;5417R 低温离心机购自 Eppendorf 公司;MultiskanMK3 型酶标仪购自Thermo 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

大鼠随机分为4 组,其中单笼组9 只,单笼饲养于白色不透明笼盒内。 新奇组、丰容组、对照组各12 只,3 只/笼饲养于透明笼盒内。 所有笼盒尺寸都为:47 cm×31.5 cm×20 cm。 盒内添加杨木刨花和玉米芯颗粒为基础垫料。

1.3.2 环境丰容方案

丰容材料购自益新(中国)有限公司和北京美绿洲生物科技有限公司,包括3 种功能的8 种材料,详见表1。

新奇组由表1 中的3 种功能的丰容材料各取一种构成8 种丰容组合,每周提供一种组合,连续丰容8 周,期间丰容材料有损坏会及时更换。 新奇组具体丰容方案见表2。

表1 环境丰容材料Table 1 Environmental enrichment items

表2 新奇组丰容方案Table 2 Enrichment program of novelty group

丰容组动物只提供3 种功能丰容材料中的一类,同样是每周更换,期间有损坏会及时更换。 对照组和单笼组不添加丰容材料。 丰容组具体丰容方案见表3。

1.3.3 检测指标

(1)大鼠行为观察

实验第 9 周,采用瞬时扫描法记录大鼠行为[4]。 行为观察记录由同一个观察者完成,观察者提前10 min 进入动物饲养室,让动物熟悉一下后再进行观察记录。 每日观察时间为上午10 ～11 点,下午4～5 点,连续观察7 d,共14 h。

采用瞬时扫描法顺序观察笼盒内的每一只动物,扫描间隔为10 s(即每只动物观察10 s),则1 h的观察时段内每只动物可记录8 个行为频次,连续7 d 的观察后,每只动物可以记录112 个行为频次。

结合对大鼠行为的观察和文献描述制定大鼠行为谱[4],详见表4。

(2)大鼠促肾上腺皮质激素和皮质酮的测定

试验第7 周时抓取大鼠按摩腹部促进排尿,每只取尿样50 μL,-20℃冻存。 9 周后解剖时取腹主动脉血,分离血清-20℃冻存。 用购自上海江莱生物科技有限公司的ELISA 检测试剂盒检测尿液和血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)浓度。

表3 丰容组丰容方案Table 3 Enrichment program of environmental enrichment group

表4 大鼠行为谱Table 4 Ethogram for behavioural elements recorded

1.4 统计学方法

所有统计分析应用SPSS 19.0 软件进行处理,方差齐性的数据应用单因素方差分析比较差异,方差不齐的数据应用非参检验比较差异,P<0.05 为显著差异,P<0.01 为极显著差异。

2 结果

2.1 雄性大鼠的行为时间分配规律

经对雄性大鼠行为频次的统计分析,发现在上午 10 ∶00-11 ∶00 及下午 16 ∶00-17 ∶00 两个时间段内,大鼠表现最多的是不活跃行为,即睡觉(平均发生32.5 次,占29%)和清醒不动(平均发生28.2次,占25.2%)。 其次为活动性行为,例如:梳理哈欠(平均发生13.5 次,占12%),探究(平均发生12.6 次,占 11%),运动活动(平均发生 8.3 次,占7%),控制垫料(平均发生7.1 次,占6%)。 采食和饮水各平均发生5.2 和2 次,占5%和2%。 发生频率最少的是社交行为,非攻击性社交平均发生1.9次,占2%,而攻击行为发生0.7 次,占1%。

如表5 所示,丰容组和对照组两组间除对照组采食行为增加外,其他各行为都无显著差异。 单笼组动物不活跃行为增加,如清醒不动显著高于新奇组和对照组,探究性行为减少,控制垫料的行为显著低于对照组(P=0.02),单纯性活动行为极显著高于其他组(P<0.01)。 而新奇组探究性行为极显著高于其他三组(P<0.01)。

2.2 雄性大鼠尿液和血液中ACTH 和CORT 的浓度

利用ELISA 试剂盒检测大鼠尿液中和血清中的促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)的浓度。 检测结果显示,血清中各组间 ACTH 和CORT 的浓度无显著性差异。 尿液中 ACTH 和CORT 浓度呈现新奇组>单笼组>对照组>丰容组的趋势,但除新奇组ACTH 极显著高于其他三组,其他差异不显著。 另外,CORT 在尿液中浓度要高于血清中的。 详见表6。

表5 雄性SD 大鼠行为频次Table 5 Behavioural performance of SD rats

表6 雄性SD 大鼠ACTH 和CORT 的浓度Table 6 Concentration of ACTH and CORT

3 讨论

环境丰容的实施目的是让动物表达天性行为,改善动物福利[5]。 丰容材料的选取应考虑动物的行为需求,确保动物能够使用这些材料,对这些材料感兴趣[6]。 在给予动物丰容材料时可进行动物对材料的偏爱性观察,如直接观察动物对丰容材料的反应,也可间接通过痕迹来判定动物是否对丰容材料有反应,还可以与预期目标进行对比来初步判定丰容效果[7]。 在本实验中根据文献[8]及啮齿类动物的天性,选取了3 种功能的丰容材料:筑巢材料、遮蔽物、磨牙棒。 实验过程中发现雄性大鼠对于筑巢材料未达到预期效果,纸屑筑巢材料基本平铺在笼盒中,未有筑巢行为发生,棉棒被大鼠撕咬打开,但同样未有明显的筑巢行为发生。 这可能是因为本实验的大鼠都为雄性,筑巢行为不是其特殊需求[9]。 对于两种材质(纸质和尼龙)的4 种遮蔽物,都有观察到大鼠对其反应,使用情况良好,尼龙材质比较耐用,实验期间未有损坏,而纸质遮蔽物一般一周就需更换。 观察到与大鼠互动最多的丰容材料为磨牙棒,但在实验中也发现不同动物对不同的丰容材料有明显的偏爱。 两种材质的磨牙棒:木质和尼龙材质。 有的大鼠偏爱木质磨牙棒,对尼龙磨牙棒不理睬,而有的大鼠刚好相反。 因此在制定与实施丰容方案前应根据大鼠对丰容材料的偏爱对其进行筛选。

量化分析动物行为的改变是评价环境丰容效果的有效方法。 其中扫描法获得动物行为时间分配是比较容易操作的一种。 本实验中在进行大鼠行为时间分布观察前,先进行了大鼠12 h(动物照明时间)行为观察,选取大鼠行为最丰富或者最活跃的时间段(上下午各1 h)进行后续观察。 即使是在此时间段内,大鼠最主要的行为也是清醒不动或睡觉(占比超过50%)。 实验动物因为标准化圈养的关系,食物饮水提供充足,觅食行为减少,笼盒大小无法充分满足它们的活动需要,限制了它们的活动量,导致其行为发生适应性变化[10],动态和积极行为减少,而动态和积极行为是动物的自然行为,是表现生命活力的行为[11]。 因此有必要根据实验动物的需求设置一定的环境丰容材料,以改善实验动物的行为。

本实验中,单笼组大鼠的不活跃行为(睡觉和清醒不动)增加,探究性活动减少,而单纯性活动极显著增加。 笼养大鼠典型的刻板行为之一即为在笼盒内不停转圈,此种行为可由单纯性活动增加逐渐演变而来[12]。 本实验中单笼组大鼠虽还未观察到明显的刻板行为,但是已经有显著的单纯性活动增加。 大鼠作为群居动物,单笼饲养阻碍了大鼠间的相互交流,是对动物福利的损害[13]。 环境丰容后,新奇组探究行为极显著高于其他三组,由此可见环境丰容能够明显改善SD 大鼠的行为,使其不活跃行为减少,促进并展示出了更多的积极行为。放置环境丰容材料后,大鼠有了新的乐趣,而且躲藏在遮蔽物中以及磨牙与其生活习性相适应。 前人的研究也表明,环境丰容能够增加动物的活动性行为[14],减少异常行为及不活跃行为,说明环境丰容对动物行为具有积极影响[15]。

肾上腺皮质激素是动物应激反应的重要标志物,文献中也常用皮质激素来反映动物的福利水平[16-17]。 在大鼠中主要的皮质激素为皮质酮(CORT)。 血清中为蛋白结合的皮质酮,尿液中为游离皮质酮,即有活性的皮质酮[18]。 同时因为尿液采集对动物无损伤,所以逐渐被人们所提倡。 本实验的检测结果,尿液中皮质酮的浓度是显著高于血清中的,说明尿液完全可以取代血清,而且可能比血清更为灵敏。

本实验中,新奇组尿液中ACTH 与COAT 都是最高的,且ACTH 极显著高于其他三组,说明新奇组的丰容方案可能给动物带来了一定程度的应激。一种可能是新奇组给动物提供3 种丰容材料,且每周更换不同的组合,这对动物来说是一种明显的刺激,导致应激的产生。 此外,丰容材料越多,相应的动物需要的饲养空间也越多,但是笼盒面积是固定的。 增加的丰容材料侵占了大鼠的饲养空间,对其造成了压力,引起了应激[19]。 由此可知,实验动物环境丰容并不是丰容材料越多越好,丰容方案越新奇越好,要根据饲养条件选择合适的丰容材料和方案[20]。

尿液中ACTH 与COAT 浓度呈现出单笼组、对照组、丰容组递减的趋势,但差异不显著。 提示本试验采取的单一材料环境丰容方案确实可能提高了动物的福利水平,降低了SD 大鼠的皮质激素的水平。 但由于一是本实验中即使是对照和单笼饲养也都给予了杨木刨花和玉米芯颗粒的垫料,二是实验持续时间还不够久,带来的激素改变还没达到统计学显著水平[21]。

综上所述,作为群居动物,单笼饲养SD 大鼠会减少其探究行为,增加其不活跃行为及单纯性活动行为,极易导致产生刻板行为,是对大鼠福利的损害。 而环境丰容有助于改善SD 大鼠的行为,提高动物福利,但过于复杂新奇的环境丰容也可能对动物带来压力,产生应激。 因此应在基于动物需求的基础上,根据动物实际饲养条件,选择简单实用的环境丰容材料和方案,既确保丰容措施能够改善动物福利水平,又能确定环境丰容措施的使用不给动物带来新的刺激和压力。