东莞地区热带念珠菌临床分离株耐药性及基因分型研究

李少洪，郭主声*,张 莉,林偲思,谢树金,冯剑波,黄 亚,陈桂铃,黄晓君,黄 彬

(1.中山大学附属东莞东华医院 微生物室,广东 东莞523110;2.中山大学附属第一医院 检验医学部,广东 广州510000)

在全球范围内，随着广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的使用及侵入性诊疗技术的应用，真菌所致的感染明显增多。尽管白色念珠菌是院内真菌感染的主要致病菌，但是非白念珠菌，尤其是热带念珠菌感染的发病率逐渐增高。根据ARTEMIS全球抗真菌监测网调查41个国家中的142个医疗中心所得数据，在1997年-2000年间热带念珠菌分离率仅为5.4%，在2001-2004年为7.5%，2005-2007年上升为8%[1]。此外，根据中国医院侵袭性真菌监测网(National China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net，CHIF-NET)数据，2010-2014年热带念珠菌分离率是15.7%[2]。近年来，在国内某医院热带念珠菌分离率高达25.8%[3]。目前，热带念珠菌已经成为非白念珠菌中最常见的病原菌。但是，相对于白色念珠菌，关于热带念珠菌的临床分布特点和药物敏感性信息相对较少。另外，由于热带念珠菌具有容易形成生物膜的特点[4]，使其有较强的黏附性，导致院内消毒容易残留、患者反复感染，甚至出现院内播散，因此对菌株进行同源性分析，确证是否出现同一克隆菌株的院内传播具有非常重要的意义[5]。现对2016年1月-2017年12月期间从中山大学附属东莞东华医院患者标本中分离得到的92株非重复热带念珠菌进行临床分布特点和药敏结果分析，并采用采用多位点序列分型法(MLST)对其进行分型，以了解本院热带念珠菌感染分布特点和基因分型，为临床选择抗真菌药物提供一定的依据，也为防控该类菌的感染与传播提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源

1.2 仪器和试剂

培养基有血琼脂平板、沙保罗平板、改良SHADOMY琼脂真菌药敏平板和法国科马嘉显色培养基。微生物鉴定和药敏系统有VITEK 2-COMPACT全自动微生物分析仪、真菌鉴定卡YST、ATB FUNGUS3药敏试剂条和丹麦Rosco酵母菌药敏纸片、德国Eppendorf公司的Mastercycler nexus PCR扩增仪和微量核酸蛋白检测仪、以及美国Bio-Rad公司的电泳成像系统。

1.3 病原菌鉴定和ATB FUNGUS3药敏试验

按照操作规程，分纯在沙保罗平板上的真菌菌落，转种在科马嘉显色培养基，置于35℃培养18-24 h，同时用全自动微生物分析仪的YST卡对其进行进一步鉴定。对于鉴定为热带念珠菌的菌落，用ATB FUNGUS3药敏试剂条检测此菌种体外对抗真菌药的敏感性。抗真菌药物包括5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)，两性霉素B(Amphotericin B，AMB)，氟康唑(Fluconazole，FCA)，伊曲康唑(Itraconazole，ITR)和伏立康唑(Voriconazole，VRC)，按照说明书操作进行药敏试验，其结果参照CLSI M27-A抗真菌药敏试验标准判定。5-FC的MIC≤4 μg/ml为敏感，≥32 μg/ml为耐药；两性霉素B的MIC≤1 μg/ml为敏感，≥8 μg/ml为耐药；FCA的MIC≤8 μg/ml为敏感，≥64 μg/ml为耐药；ITR的MIC≤0.125 μg/ml为敏感，≥1 μg/ml为耐药；VRC的MIC≤1 μg/ml为敏感，≥4 μg/ml为耐药。

1.4 基因组DNA 的提取

用酵母基因组 DNA 提取试剂盒(DP307)提取热带念珠菌基因组DNA，具体操作按说明书进行。用微量核酸检测仪检测提取DNA的纯度和质量，符合要求者置于-30℃冷冻保存，用于后续实验。

1.5 MLST分型检测本项目运用多位点序列分型方法(MLST)对热带假丝酵母进行同源性分析。首先，提取热带假丝酵母基因组，然后根据数据库pubmlst以及相关文献报告选择6个热带假丝酵母菌的管家基因(ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a)进行PCR扩增，将PCR产物测序，测序结果与标准序列比对后上传至数据库，然后可分别获得相应6对管家基因组成的等位基因谱和序列分型编号(ST)，PCR反应体系和引物序列见表1和表2。

表1 PCR反应体系

2) 扩增条件如下：以上6个管家基因扩增条件均为：

1.6 系统进化树分析将每个菌株的6段管家基因序列片段连接为一整条，应用MEGA 5.2分析软件，采用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)对92株热带念珠菌进行同源性分型，并绘制进化树图，研究热带念珠菌菌株之间的相关性。

因此，小孩若有脾胃疾病如食欲不振、厌食、腹泻、便秘，肺系疾病如反复感冒、咳嗽，神经系统疾病如夜啼、睡眠不安、爱哭闹等，捏脊疗法有一定的治疗作用。其中，因在治疗小儿食积、食欲不振、消化不良等方面疗效尤为突出，故捏脊法又有“捏积”之称。

1.7 统计学处理采用世界卫生组织细菌耐药性监测网提供的WHONET 5.6软件进行数据统计，应用 MEGA 5.2软件中UPGMA方法进行数据处理。计量资料数据用(均数±标准差)表示。计数资料，采用卡方检验或 Fisher确切概率法对分类变量进行构成比比较，采用配对卡方检验检测两种真菌药敏方法是否具有一致性，P<0.05为差异有统计学意义。

表2 多位点序列分型法扩增管家基因引物序列及测序范围

2 结果

2.1 年龄分布本研究共鉴定出的非重复热带念珠菌92株，在各个年龄组均可见。 21-40岁，41-60岁，61-80岁年龄组菌株数相近，分别为24株(26.09%)，25株(27.17%)，22株(23.91%)。 而0-20岁和81-100岁年龄组菌株较少，分别为8株(8.70%)和13株(14.13%)。 平均年龄为(51.56±24.04)岁。

2.2 性别分布92株热念菌株来自男性55株，女性37株，构成比分别为59.78%和40.22%。

2.3标本类型分布标本主要来源于尿液(40株)，伤口分泌物(14株)，血液(10株)，灌洗液(8株)，生殖道分泌物(7株)，引流液(7株)。余下6株分别来自胸水，胆汁，脓液，脑脊液，穿刺液和大便各1株。

2.4 临床科室分布分离出的热带念株菌来源于前三的临床科室分别为： ICU20株(21.74%)，急诊病区12株(13.04%)，神经外科12株(13.04%)。 妇产科和儿科的菌株分别来自阴道分泌物标本5株(5.43%)和全血标本4株(4.35%)。除去 ICU、急诊病区、妇产科和儿科，在普通病房中，外科病房分离出28株(30.43%)，略高于内科病房分离率(25.00%)。在外科病房中，神经外科分离率最高。内科病房的热带念株菌主要分离自肿瘤内科(4株)、血液内科(4株)、肾病风湿科(4株)、内分泌科(3株)和呼吸内科(3株)。

2.5 药敏结果药敏试验用ATB FUNGUS3试剂条。92株热带念珠菌从21-40岁患者分离出的热带念珠菌的FCA、ITR和VRC敏感率最高，分别为为87.5%、66.7%，91.7%。 而从41-60岁患者分离出的菌株对FCA、ITR和VRC敏感率最低，分别为为68.0%、44.0%和72.0%。来自女性和男性患者的分离株的 FCA、 ITR和 VRC敏感率依次为75.7%和 78.2%、51.4%和50.9%、81.1%和80.0%。来不同科室热带念珠菌的抗真菌制剂敏感率是不一致的，其中，分离自妇产科病区的热念菌敏感性最高，对5- FC、 AMB、 FCA和 VRC的体外敏感性全是100%，而对 ITR的敏感性是80%； 然而，内科病区分离出的热念菌体外对唑类制剂的敏感性最低，其 FCA，ITR和 VRC敏感率分别为56.50%、39.10%和56.50%。儿科病区分离出的热念菌对FCA和ITR敏感率也偏低，分别为75%和50%。 卡方检验结果表明：只有不同科室分离出的热带念珠菌的FCA、ITR和VRC体外药敏试验结果的差异性分布具有统计学意义。不同年龄、不同性别及不同科室来源分离的热念菌株的FCA、ITR和VRC敏感率见表3。

用ROSCO纸片法对92株热念菌进行药敏实验，结果为： AMB 、FCA、ITR和VRC敏感率分别为100%、84.78%、41.30%和84.78%；而用ATB FUNGUS3试剂条进行药敏试验，结果为AMB、FCA、ITR和VRC敏感率分别为100%、85.87%、56.52%和89.13%，药敏结果比较详见表4。

2.6 MLST分型分析和系统进行树分析92株热带念珠菌的ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a管家基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱结果与预期结果一致，且条带清晰，后测序结果上传与标准MLST数据库比对，发现热热带念珠菌的4个管家基因ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4等位基因编号为1、7、22、52，对XYR1和ZWF1a管家基因的比对结果发现存在突变，为新的ST型(STnew1-STnew72)，占总菌数的78.3%(72株)。92株临床分离株聚成三大簇，26株唑类耐药株在进化树中呈集中分布，其中有24株分布于第一簇(平均遗传距离为0.007)中，且22株聚集于一个分支上；有2株分布于第二簇，但处于距离第一簇接近的位置。

表3 不同年龄、不同性别及不同科室来源分离的热带念珠菌对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感率

表4 K-B法和MIC法对92株热带念珠菌的敏感性

3 讨论

除了白色念珠菌，热带念珠菌是侵袭性真菌病的最主要致病菌，可引起真菌血症和全身播散性感染。热带念珠菌常被认为在毒力和临床重要性上仅次于白念珠菌，尽管近年来 在一些区域这种流行病学特点转移到光滑念珠菌和其它非白念珠菌[4]。不同地区之间的热念菌分离率、临床分布特点和耐药性存在一定差异。热带念珠菌具有独特的热带气候分布性，其在念珠菌血症的分离率随着地理位置不同而改变： 美国12%-25%、欧洲4.5%-9%、巴西20%-24%、南亚20%-60%以上[6]。有研究证实，热带念珠菌血症常见于血液系统肿瘤、中性粒细胞缺乏的病患[7]。 同其它研究一致，本研究92株热带念珠菌有10株分离自血液标本，主要来源于血液科、肿瘤内科和ICU患者。 值得注意的是，有4株(4.35%)分离自儿童血液标本，其中3株来自新生儿。 早产儿、极低体重儿、使用呼吸机、留置中心静脉导管、长时间使用抗生素特别是三代头孢抗生素、静脉营养是新生儿发生真菌血症的高危要素[8]。 最近的一份研究报道指出：儿童突破性真菌血症是引起死亡的一个显著独立因素[9]。真菌血症的早发现、诊断及治疗对于新生儿是至关重要的。

除了菌血症，念珠菌还常感染泌尿系统，且常以院内感染的形式出现，而社区获得性感染在尿路结构正常的人群中较少发生[10]。念珠菌可通过血流进入尿路(顺行感染)或在尿道处或附近定植而上行进入尿路(逆行感染)[11]。热带念珠菌是侵袭泌尿系统最常见的非白念珠菌。 本研究中40株热带念珠菌分离自尿液标本，主要来自ICU、急诊病区、神经外科病房患者。 这可能因为这些科室患者多为病情危重复杂，需长期卧床、留置导尿管、长期使用抗菌药物或糖皮质激素而导致菌群分布异常和失调。

关于本研究中的92株热带念珠菌，ICU科室分离鉴定率最高(21.74%)。 20株分离自 ICU患者的热带念珠菌标本分别是尿液(8株)、引流液(6株)、伤口分泌物(3株)、外周静脉血(2株)和脑脊液(1株)。 由于基础疾病重、免疫力下降、身上多种留置管道(导尿管、引流管、中心静脉管路和气管插管或切开等)和广谱抗菌药物泛用，入住 ICU的病患易受真菌侵袭，且感染率较普通病区高[12]。除了白念和近平滑念珠菌，热念菌亦是ICU常见致病真菌。而留置管道的地方常易受真菌感染，比如血液、尿道、呼吸道和胸腹腔等。

由于可口服、生物利用度高且副作用较小，FCA是临床上最常用的唑类抗真菌制剂。热念菌在世界范围内对唑类制剂的耐药率是不同的： 亚洲地区热带念珠菌FCA耐药率11%-15%，高于美国(常低于7%)和欧洲(0-12%)[12-13]。 CHIF- NET研究中心监测中国10家三甲医院获取的数据可知，热带念珠菌对 FCA的 非敏感率从2010年的11.2%增长至2014年42.7%。 本研究中热带念珠菌的非敏感率将近23%，稍高于 CHIF- NET监测网2014年广州某医院18%的非敏感率，这可能与近年本院加大使用 FCA来预防念珠菌感染有关。分离自内科病房患者的热念珠菌，其FCA非敏感率最高(43.5%)。值得注意的是，来自血液科患者全血的4株热带念珠菌，对FCA、ITR和VRC均耐药。由于热带念珠菌易侵袭血液恶性肿瘤、中性粒细胞缺乏和骨髓移植病患，引起真菌血症和全身播散性感染，所以唑类药物常被血液科用于预防性真菌感染，这可能导致唑类耐药率高于其他临床科室[6]。

在本次研究中，92株热带念珠菌对5- FC、 AMB、 FCA和 VRC体外敏感率分别为100%、100%、85.87%和89.13%，而对 ITR的敏感率只有56.52%，剂量依赖性敏感率30.43%。 ITR体外药敏的敏感率偏低，这可能是因为体外药敏试验中念珠菌对 ITR的判断是参照黏膜感染的标准制定的，而亲脂性很强的 ITR在多种组织中的浓度超过血液药物浓度，且 ITR在体内的代谢产物羟基伊曲康唑同样能抑制念珠菌[14]。 因此临床使用的ITR对不同感染部位的抗真菌疗效可能会不同。

值得注意的是，在唑类制剂耐药性增加的同时，热带念珠菌对这类药物出现了交叉耐药。在ARTEMIS研宄里，其中对FCA耐药的热念菌中，只有17%的菌株对VRC敏感，而67.7%的菌株同时产生ITR交叉耐药[1]。 而本研究中，13株对FCA、ITR和VRC交叉耐药； 16株耐FCA的菌株100%对ITR和VRC非敏感，其中81.25%和87.5%菌株分别对ITR和VRC耐药。大部分的耐药菌株分离自ICU、急诊病区和血液科。

MLST是目前分子分型经常使用的方法，并在流行病学的应用已经得到研究的支持，例如评估局部感染、评价菌群结构等[15],本研究运用MLST对热带念珠菌进行同源性分析，92株热带念珠菌的ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a管家基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱结果与预期结果一致，且条带清晰，后测序结果上传与标准MLST数据库比对，发现热热带念珠菌的4个管家基因ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4等位基因编号为1、7、22、52，对XYR1和ZWF1a管家基因的比对结果发现存在突变，共产生72株突变新系列型，92株临床分离株聚成三大簇，26株唑类耐药株在进化树中呈集中分布，其中有24株分布于第一簇中，且22株聚集于一个分支上，说明这些唑类耐药性在亲缘关系上十分接近。