颅脑损伤后弥漫性轴索损伤的CT表现与患者神经元水通道蛋白表达的相关性

阮娇妮，宋黎涛

(上海中医药大学附属第七人民医院 医学影像科，上海200137)

弥漫性颅脑轴索损伤(DAI)是指头部受到外伤引起的弥漫分布于脑白质、以轴索损伤为主要改变的一种原发性脑实质的损伤[1-3]。DAI作为神经外科中一种多发的常见疾病，对患者健康及生命安全存在严重威胁[4-5]。计算机断层扫描(CT)由于成像速度快，骨折信号显示较好，长期以来一直是DAI诊断的首要检查方式，其对于DAI的及早诊断及治疗、提高患者治愈及预后效果起着积极的作用[6-7]。

水通道蛋白(AQP)广泛分布在细胞膜上，对细胞水代谢起着重要的调节作用，是一组与水通透密切相关的细胞膜转运蛋白[8-10]。研究表明，脑组织中大量存在着AQP-1、AQP-4和AQP-9，在脑脊液的生成过程中发挥着重要作用[11]。近年来大量研究证实AQP-4与颅脑损伤高度相关[12]，但是关于DAI的CT表现与患者神经元水通道蛋白表达的相关性研究却鲜见报道。基于此，本文研究了颅脑损伤后DAI患者的CT表现和神经元水通道蛋白的表达水平，并对两者的相关性进行了分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2019年12月就诊于上海中医药大学附属第七人民医院神经外科的150例创伤性颅脑损伤患者为研究对象，经CT检查和临床诊断后所有患者均为弥漫性轴索损伤。临床表现为恶心、呕吐、头痛及不同程度昏迷等。

DAI患者根据颅脑CT和GCS(格拉斯哥昏迷)量表评分判定颅脑损伤程度，并将患者分为轻型、中型及重型三组。其中轻型组GCS评分在13-15之间，颅脑CT无明显异常；中型组GCS评分在9-12之间，颅脑CT中显示部分血肿及出血，中线结构呈现<3 mm的移位；重型组GCS评分在3-8之间，颅脑CT中显示颅内散布出血灶及蛛网膜下腔出血，脑池封闭或变窄梗死，中线结构呈现3 mm以上的移位。选择同期入院的50名健康体检者作为对照组。

1.1.1入选标准 DAI患者纳入标准： ① 经头部CT及临床诊断确诊；②入院时GCS量表评分>3分，表现出不同程度的语言和认知障碍，脑颅损伤原因明确者；③行开颅手术治疗；④伴有恶心、呕吐、头痛及不同程度昏迷等临床症状者。

1.1.2排除标准 DAI患者排除标准：①病情迅速恶化且在短时间内死亡患者；②开放性颅脑损伤患者；③临床信息缺失、不全者；④首次CT检查需即刻手术患者；⑤抑郁、狂躁、精神分裂等精神系统疾病患者；⑥心脏病、糖尿病、肝肾功能不全者等；⑦恶性肿瘤患者；⑧自身免疫性疾病患者；⑨存在脑颅损伤既往史、癫痫等其它精神疾病史者。

1.1.3医学伦理问题 受试者遵循自愿参加的原则，签署研究同意书，并经过我院伦理委员会批准。依据临床研究指南充分保障受试者的隐私及安全。

1.2 方法

1.2.1一般资料 记录研究对象年龄、性别、第一次CT时间等一般指标，比较并排除组间差异。

1.2.2CT检查方法 所有患者均在颅脑损伤24 h内采用美国GE Highspeed双层螺旋CT机进行CT扫描。患者取仰卧位，颈部置于伸屈中间位(眼耳平面垂直于地)，家属协同患者尽量使其头部保持静止状态，减少运动伪影的产生。采用横轴位连续扫描，扫描参数为：电压120 kV，电流150 mA，视野25 cm，矩阵512×512，层厚10 mm，层间距为10 mm，扫描基线与OML(外龇与同侧外耳道口连线)平行，自颅底至颅顶持续性无间隔扫描，并在疑似病灶位置进行层厚为5 mm的薄层扫描。

1.2.3颅脑水肿带面积 根据患者颅脑CT图片中水肿带面积评估脑水肿情况，其中水肿带面积以CT影像中最大水肿层面计。公式如下：颅脑水肿带面积=(水肿带外长径×水肿带外长径)-(水肿带内长径×水肿带内短径)。

1.2.4Gless神经纤维及轴索染色法 开颅手术过程中取三组患者水肿或挫伤灶周边1-2 cm处脑组织标本，并取远隔脑血肿及挫伤处相对正常的脑组织作为对照组。将各标本用20%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇浸泡、石蜡包埋、平面脑组织切片后，60℃烘烤25 min。脱蜡水化、蒸馏水浸泡后，20%新鲜配置硝酸银浸渍30 min，10%福尔马林还原3次。随后浸入新鲜配置的Gless胺银溶液30 s，10%福尔马林还原3次，蒸馏水反复清洗2次，硫代硫酸钠(5%)固定2 min，水洗。梯度酒精浸泡脱水，二甲苯溶液将其透明化后，中性树胶封片晾干。将封片置于显微镜下，观察患者脑组织病理形态变化并记录视野下轴索损伤数。

1.2.5RT-PCR法检测患者血清中AQP-4基因表达的影响 抽取对照组及三组DAI患者组空腹静脉血(颅脑损伤后24 h内、3 d及7 d)，采用聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测血清中AQP-4水平。PCR扩增条件为：94℃预变性2.5 min，93℃变性30 s，60℃退火25 s，70℃延伸30 s，循环35次，最后71℃延伸60 s。取10 μl扩增产物和6 μl的Maker同时上样，于3.0%的琼脂糖凝胶电泳分离(120V 40 min)，银染色，紫外凝胶成像系统分析扩增结果并拍照。

1.2.6Western blot分析AQP-4蛋白表达水平变化 配置一定浓度的SDSPAGE电泳凝胶并置于电泳槽上，将各组条件下细胞制备的蛋白(CREB、pCREB)上样并电泳。电泳后转印到PVDF膜上，封闭并用TBST清洗后分别加入稀释过的蛋白抗体(1抗)，4℃过夜，TBST清洗4次(每次5 min)；随后加入HRP标记的2抗，37℃孵育2 h，TBST洗4次*5 min。设立阴性对照组，以GAPDH单克隆体为一抗，HRP标记的IgG为二抗。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0统计分析软件进行数据处理；统计结果均采用“均数±标准差”表示；多样本间均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用最小显著差异LSD-t检验；P<0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般情况

对照组及三组DAI患者基本情况如表1所示。由表1可知，各组患者在年龄、男女比例及颅脑损伤后第一次CT时间均无明显差异(P>0.05)，可排除上述因素对测试结果造成的干扰，数据具有可比性。见表1。

表1 患者一般资料

2.2 各组脑组织病理形态学变化

各组患者弥漫性轴索损伤病理形态学变化如表2所示。镜下观察显示，对照组脑组织结构完成，神经细胞排列整齐，胞浆丰富，细胞间隙正常，无轴索损伤；DAI轻型组脑组织疏松，神经元细胞周围出现透明间隙，呈轻微水肿状，轴索损伤数较对照组差异显著(P<0.05)；DAI中型组神经细胞水肿，细胞核浓缩，水肿和轴索损伤加剧(P<0.05)；DAI重型组病变更加明显，血管和细胞周围间隙进一步扩大，空泡样明显，水肿情况更加严重，轴索损伤数目最多。见表2。

表2 各组患者弥漫性轴索损伤的病理形态学变化

2.3 患者颅脑水肿情况比较

对照组及各组DAI患者颅脑水肿情况比较见表3。由表3可知，健康对照组颅脑CT显示无水肿情况发生，颅脑损伤后，各DAI组均出现颅脑水肿情况。随着弥漫性轴索损伤程度的增加， 水肿带面积较轻型组明显增大，组间差异显著，具有统计学意义(P<0.05)。结果表明随着弥漫性轴索损伤程度的增加，患者颅脑水肿情况更加严重。

表3 患者颅脑水肿程度比较

2.4 颅脑损伤后弥漫性轴索损伤的CT表现

病灶形态呈结节状、卵圆型或斑点状，CT影像呈现较高密度，边界清晰，未见明显占位效应；部分伴发颅内损伤患者呈现脑裂变窄、脑池变小，蛛网膜下腔出血、硬膜下血肿等。

2.5 各组患者血清中AQP-4基因表达水平的变化

AQP-4及GAPDH引物设计见表4。

表4 PCR过程中引物序列设计

对照组及各组DAI患者血清中AQP-4水平见表5。由表5可知，对照组在各时间点AQP-4水平均较为稳定，各DAI患者组血清中AQP-4水平在术后3天均达到高峰，术后7天水平有所降低，各组颅脑损伤患者在24 h内、3天、7天血清中AQP-4水平差异显著，具有统计学意义(P<0.05)。与健康对照组相比，各时间点DAI患者组血清中AQP-4水平均显著升高，差异显著(P<0.05)；且随着弥漫性轴索损伤程度的增加，AQP-4升高程度更加明显。结果说明颅脑弥漫性轴索损伤具有促进神经元水通道蛋白AQP-4释放的功能，AQP-4的释放进一步提高影响脑组织通透性，加剧脑组织的水肿及损伤程度。

表5 RT-PCR 检测AQP-4基因表达情况

2.6 各组患者脑组织AQP-4蛋白表达水平的变化

对照组及各组DAI患者脑组织中AQP-4蛋白表达水平见表6。由表6可知，与对照组相比，各DAI患者组脑组织中AQP-4水平显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。随着弥漫性轴索损伤程度的增加，AQP-4蛋白表达水平进一步提高，差异显著(P<0.05)。

表6 AQP-4蛋白表达情况

2.7 各组患者CT表现与AQP-4蛋白表达的相关性

Spearman相关分析表明，各组患者CT表现与AQP-4蛋白表达水平呈明显正相关(r=0.78，P<0.05)。提示AQP-4蛋白可作为判断弥漫性颅脑轴索损伤的分子标记物。

3 讨论

弥漫性轴索损伤(DAI)是在头部受到外力作用后，以轴索断裂为主要特征的原发性弥漫性脑损伤[13-14]。目前对DAI病情及预后的评估主要依赖于医学影像、临床症状和生命体征等。CT可清晰的显示DAI脑水肿及出血灶情况，但对非出血性直径小于2 cm的微小病灶不敏感，不能准确的反应病变程度[15,16]。神经元水通道蛋白AQP-4主要分布在血脑屏障血管周围，对中枢神经系统中液体的转运起着重要的调节作用，同时也参与血浆胶体渗透压的调控[17-19]。研究表明，正常生理状态下脑细胞中AQP-4水平较低，当神经细胞受损后，AQP-4可通过血脑屏障进入脑脊液，在弥漫性轴索颅脑损伤的发生、发展进程中发挥着重要的作用[20]。

目前，关于DAI的CT表现与患者神经元水通道蛋白表达的相关性研究鲜见报道。基于此，本文选取经CT检查和临床诊断为弥漫性轴索损伤的150例患者为研究对象，根据颅脑CT和GCS量表评分将患者分为DAI轻型、中型及重型三组，并以同期入院体检的50名健康体检者作为对照组。各组患者在年龄、性别及颅脑损伤后第一次CT时间均无明显差异，数据具有可比性。弥漫性轴索损伤病理形态学及颅脑水肿结果表明，DAI各组脑组织结构疏松、呈水肿状，轴索有一定程度的损伤，且随着损伤程度的增加，水肿程度及轴索损伤数量急剧增加，差异显著(P<0.05)。颅脑CT影像结果表明，典型的DAI病灶呈结节状、卵圆型或斑点状，密度较高，无明显占位效应；部分伴发颅内损伤患者呈现脑裂变窄、脑池变小，硬膜下血肿等，与患者临床诊断一致，可作为DAI快速高效诊断的有效依据。为了进一步探究弥漫性轴索损伤的CT表现与患者神经元水通道蛋白表达的相关性，我们采用RT-PCR和Western blot法检测了患者血清及脑组织中AQP-4水平的变化。RT-PCR及Western blot检测分析表明，与健康对照组相比，各DAI患者组血清及脑组织中AQP-4水平显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。随着弥漫性轴索损伤程度的增加，AQP-4表达水平进一步提高，差异显著(P<0.05)。结果说明颅脑弥漫性轴索损伤具有促进神经元水通道蛋白AQP-4释放的功能，AQP-4的释放进一步提高影响脑组织通透性，加剧脑组织的水肿及损伤程度。Spearman相关性分析表明，各组患者CT表现与AQP-4蛋白表达水平呈明显正相关，提示AQP-4蛋白可作为判断弥漫性颅脑轴索损伤的分子标记物。

综上所述，颅脑CT影像可作为DAI快速高效诊断的有效依据，患者神经元水通道蛋白AQP-4表达水平与颅脑损伤DAI的CT表现正相关，提示AQP-4可作为判断DAI病情及预后的一个重要指标，这就为临床诊断及治疗DAI提供了一种新的无创检测手段，具有较高的临床应用价值。