结核γ—干扰素酶联免疫法释放试验结果及影响相关因素分析

徐 宁，郑 瑞，毛小琴，撒亚莲

(1.云南省第一人民医院 检验科;2.云南省临床检验中心;3.云南省临床微生物重点实验室;4.云南省第一人民医院 临床基础医学研究所，云南 昆明650032)

快速诊断和治疗是结核病控制的关键问题，至今没有一种准确、快速、可靠，检测结核分枝杆菌(结核菌)感染的方法[1]。常用细菌学检测方法，如痰涂片镜检法和培养法，以及结核菌临床基因扩增法、血清学检测方法等。但这些方法存在敏感性较低、特异性较差、操作复杂，检测周期长等问题[2]。世界卫生组织 2014 年的报告显示，结核病诊断率仅为37%[3]，即使在发达国家，仅有50%结核病例通过细菌学方法证实[4]。因此，开发快速特异诊断结核病的方法已经成为控制结核病蔓延的紧迫任务。结核菌可诱导强烈的细胞免疫反应，因此，检测结核菌特异的T淋巴细胞可作为检测感染的一种新路径[5]。本研究对960例γ干扰素试验结果进行调查分析，探讨其在结核病快速诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料采用整群定点抽样法，选取2019年1月至 2019年12月在云南省第一人民医院住院的疑似结核患者为研究对象，其中男528例，女432例，年龄40-67岁，平均(49.14±17.42)岁。

1.1.1纳入标准 阳性组均为云南省第一人民医院门诊及住院患者，且经相关病理及细菌学检查和临床转归而最终证实的结核感染患者516例，其中男 288例，女 228 例，年龄 49-67岁，平均(49.14±17.81)岁。而阴性组则是疑似结核，最终通过其他检查排除结核患者444例。其中男240例，女204例，年龄40-58岁，平均(40.86±17.04)。ATB(active tuberculosis,ATB)的诊断标准为：除具有典型的临床症状和影像学表现外，痰、支气管肺泡灌洗液、组织或其他送检标本中MTB培养阳性。LTBI(latent tuberculosis infection,LTBI)的诊断标准为：常规筛查中结核γ—干扰素试验阳性，但无结核病相关的临床症状和影像学表现[6]

1.1.2排除标准(任意一条满足) (1)年龄<18岁；(2)免疫功能低下人群(糖尿病、恶性肿瘤、慢性肾功能衰竭患者)；(4)抗结核治疗>2周者。

1.2 研究方法

1.2.1样本收集与要求 住院符合条件患者入院后次日早晨空腹采样新鲜的肝素钠抗凝全血4 ml，室温保存，及时送检。同时患者检测痰涂片，有条件者纤支镜刷片查抗酸杆菌，肺外结核取相关部位涂片查抗酸杆菌，IGRA(结核γ—干扰素酶联免疫法释放试验)及病理送检。

1.2.2试剂与器材 采用QIAGEN 的结核分枝杆菌特异性细胞反应检测试剂盒(酶联免疫法)

1.3 统计学分析

应用统计软件 SPSS24.0 分析处理数据，单因素分析采用t检验和方差分析，多因素分析采用logistic回归分析,且当P<0.05时认为差异具有统计学意义。检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 γ-干扰素与病理结果的关系

干扰素释放试验结果和最终病理确诊结果的比较使用配对卡方检验，P值<0.001为差异有统计学意义，干扰素试验结果和最终病理确诊结果之间有相关。优劣性检验的双侧P值为0.290，差异无统计学意义，尚不能认为两种方法的测定结果有差别，证明γ干扰素释放试验结果和病理结果有较高一致性，见表1。

表1 960例患者干扰素释放试验结果与最终确诊结果的比较

2.2 干扰素释放量与单核细胞数量、C反应蛋白、淋巴细胞数量的相关性分析

P值分别为0.991、0.542、0.000，单核细胞数量和C反应蛋白的P值>0.05，没有相关性。淋巴细胞数量的P值<0.05，有相关性，相关系数为0.784。

2.2.1干扰素释放量与单核细胞数量相关分析,见图1。

图1 干扰素释放量与单核细胞数量没有相关性

2.2.2干扰素释放量与C反应蛋白数量相关分析，见图2。

图2 干扰素释放量与C反应蛋白数量无相关性

2.2.3干扰素释放量与淋巴细胞数量相关分析，见图3。

图3 γ干扰素释放量和淋巴细胞数量呈正相关

2.3 干扰素释放试验结果影响因素分析

本研究960例干扰素释放试验结果阳性516例，干扰素释放试验结果阴性444例，实验结果显示：在年龄、干扰素释放量、淋巴细胞、CRP等方面差异有统计学意义(P< 0.05)；而在性别、血沉方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。为了剔除混杂因素，将单因素有统计学意义的因素进行多因素分析，以阳性、阴性作为应变量，以年龄、干扰素释放量、淋巴细胞、CRP、激素使用作为自变量纳入logistic回归分析；结果提示：5个因素都是干扰素实验结果的影响因素。

表2 干扰素释放试验结果影响因素分析

3 讨论

γ-干扰素释放试验(Gamma-interferon release test，IGRAs)是检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)特异性抗原刺激T细胞产生的γ干扰素，以判断是否存在MTB的感染。IGRAs可弥补PPD试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断MTB潜伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)，LTBI是宿主感染MTB后的一种特殊状态，感染者体内的MTB处于持留状态，不能诊断为活动性结核病，但具有发展为活动性结核病的风险。对LTBI的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义[7]。研究结果提示，IGRAs诊断MTB感染的特异度与病理最终结果符合性很高，与相关研究相同[8]，而对云南HIV高发地区，其中有13例HIV患者，结核是HIV感染者死亡的首要原因[9]，而IGRAs尤其是细胞检测)受CD4+T细胞数量的影响较小，因为IGRAs检测过程中已对单个核细胞数量进行了标准化，即在检测程序上消除了淋巴细胞数量减少对检测结果的影响，从而提高了其敏感性。IGRAs诊断采用MTB的RDl区基因编码抗原多肽作为特异性抗原，主要有相对分子质量为6000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相对分子质量为10000的培养滤液蛋白(CFP-10)抗原并在此基础上增加了TB7.7抗原多肽[10]。而ESAT-6和CFP-10主要存在于MTB复合群[11]，而在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失，因此IGRAs的特异度较好,但在敏感性上γ干扰素存在一定的局限性[12]，特别是类风湿关节炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能受损患者及糖尿病等特殊患者[13-15]，因其自身原因，或接受糖皮质激素或肿瘤坏死因子TNF-a拮抗剂等免疫抑制药物治疗导致免疫功能缺陷，病人免疫系统受损，致使T细胞无法产生γ-干扰素，而导致IGRAs的敏感度并未高于PPD试验[16]，但是这类患者是LTBI发展为结核病的高风险人群，在临床工作中给予IGRAs检测结果的解释一定要根据患者综合因素进行分析。

本研究重点关注了年龄、γ干扰素释放量、淋巴细胞数量、C反应蛋白、单核细胞等各种影响因素，根据相关文献报道，非甾体抗炎类药物[17]、T细胞活化抑制剂[18]、应用糖皮质激素导致白细胞总数增多，淋巴细胞减少，导致γ干扰素减少[19]。本研究也证实，年龄、γ-干扰素释放量、使用激素、淋巴细胞数量、CRP五个因素P值均小于0.05，从而证实这些因子是γ干扰素试验的结果不确定时需要复查的确定因素。在现有结核诊断方法存在诸多缺陷的今天，γ干扰素结合相关影响因素判断结核感染，可以给临床医师提供有力参考，指导临床实践。