高砷沉积物中砷形态转化的微生物作用机制

董国文 ，陈一平,2，陈 飘 ,2，张丽华

（1.三明学院 资源与化工学院 福建 三明 365004；2.福建农林大学 资源与环境学院，福建，福州 350002）

砷的生物地球化学调查表明自然环境中微生物在砷的化学形态及循环方面起到至关重要的作用[1-2]。过程控制砷释放到地下水系统很复杂并且已经进行了广泛的研究，但仍然还存在强烈的争论。已有几个微环境实验研究表明土著金属还原微生物(例如Geobacteraceae)在砷释放到地下含水层中起到关键作用[3-7]。但有关这些土著微生物群落在砷迁移转化过程中的详细作用还没有特别描述。而可溶的自然小分子有机酸是土壤中不稳定的碳源之一，其中，乙酸一旦释放到土壤溶液中可能被土壤微生物利用，加速金属矿物的风化。淹水能改变土壤氧化还原电位引起土壤短暂缺氧，吸附到铁氧化物颗粒的砷很容易通过铁或砷还原微生物的活动而溶解。因此，在环境条件改变下土著微生物活动对沉积物中砷移动的重要性值得深入研究。特别是对环境中不可培养的砷代谢微生物的丰度和群落结构进行进一步的研究，以确定其在砷迁移转化过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 沉积物样品采集

本试验供试沉积物采自湖南省石门县雄黄矿废弃矿区附近。样品采集后密封保存于4°C冰箱备用。

1.2 实验设计

实验所用沉积物其有效态砷含量在34.15 mg·kg-1，沉积物样品厌氧培育采用105 mL血清瓶预先灭菌处理，然后添加（20±1）g沉积物，加入24 mL无菌水或溶液。液面下氮吹30 min，液面上氮吹30 min，然后盖上灰色丁基橡胶塞，用卡口钳将铝皮密闭，30°C暗处培养。沉积物中主要添加乙酸钠和Fe(III)[8]，处理方式见表1。

1.3 分析方法

样品中As(Ⅲ)的浓度采用氢化物发生原子荧光法(AF-610B北京瑞利)测定[9]，总砷采用ICP-MS（安捷伦7700X）测试。Fe(Ⅱ)的浓度采用Ferrozine法来测定(TU1900，北京普析)[10]。样品中CO2用10 μL微量进样器取样，浓度采用气相色谱测试(GC-960，上海海欣)。测试条件为柱温50℃，热导检测，载气为氩气。

沉积物样品总DNA的提取纯化按照Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedical USA)的操作说明进行。对砷的异化还原微生物进行PCR扩增，方法是采用nested PCR，先用引物F8和RGeobacteraceae-825进行扩增[11-12]，目的片段在800 bp左右，产物割胶纯化后再PCR，引物用Bacteria specific primers F357GC和R518[13]，PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。利用DGGE（变性梯度凝胶电泳）电泳仪系统(DcodeTM，Biorad)分离PCR产物，并克隆测序（上海生工）。分别采用Geobacteraceae特异引物F494-R825[14]和 As(Ⅴ)异化还原菌功能基因引物arrAF4-arrAR4[15]进行real-time PCR(ABI Step One Plus)来分析沉积物中Fe(Ⅲ)和As(Ⅴ)还原菌的相对丰度。

2 结果与讨论

2.1 厌氧环境微生物对沉积物中砷的释放

本实验以尾矿区附近高砷沉积物作为研究对象，在厌氧微环境条件下，考察外加有机碳源乙酸钠、可溶的Fe(Ⅲ)和不溶的Fe(Ⅲ)对沉积物中微生物释放砷的影响，结果见图1。在厌氧环境下，与无菌控制样品相比，沉积物中砷的迁移主要是微生物的作用。灭菌样品中砷的释放相对较少，说明矿物表面解吸不是主要的因素。沉积物中添加乙酸钠和同时添加乙酸钠及可溶Fe(Ⅲ)后，释放到水体中的砷浓度分别为59.84，61.36 mg·L-1，且主要是 As(Ⅲ)(＞90%)。从砷随着时间释放的曲线来看，培育前期加入可溶的Fe(Ⅲ)会减少砷的释放，后期会增加砷的释放，但主要影响砷释放的还是乙酸钠的贡献。只加水的样品中也有一定砷的释放，说明土著厌氧微生物还可以利用沉积物本身的有机碳源进行呼吸代谢。而加入Fe(OOH)胶体的样品释放到水体的砷几乎可以忽略，说明Fe(OOH)胶体对微生物释放到水体中的砷有吸附作用，从灭菌控制样品中也可以看出（见图2），加入Fe(OOH)胶体的样品中释放到水体中的砷的浓度比其它样品明显低。

从图3可以看出，厌氧环境下沉积物中释放砷的同时还有铁的释放，但铁的释放比砷要慢，但Fe(Ⅲ)一直都有被还原，不管是加入可溶的还是不溶的Fe(Ⅲ)，都能促进微生物还原Fe(Ⅲ)。

图1 厌氧条件下微生物对沉积物中砷的释放

图 2 厌氧条件下沉积物中砷的释放(非生物作用)

图 3 厌氧条件下微生物对沉积物中Fe(II)的释放

2.2 厌氧环境微生物对沉积物中有机碳的转化

根据图4可知，在厌氧环境下，外源的有机碳源乙酸钠和Fe(Ⅲ)都能够促进沉积物中土著微生物的活性。以有机物作为电子供体产生CO2的贡献大小依次为NaAc+Fe(Ⅲ)＞Fe(OOH)＞NaAc＞H2O。从有机碳的转化可以看出，加入可溶的或不溶的Fe(Ⅲ)后，CO2的浓度显著增加，说明Fe(Ⅲ)的加入促进了铁还原微生物的生长，异化铁还原明显加强，同时也说明沉积物中铁还原菌非常丰富。

2.3 沉积物中功能性微生物分析

在厌氧环境下沉积物中铁的呼吸代谢通常与Geobacteraceae科微生物活动相关[12,16]。故采用特异引物F8和RGeobacteraceae-825对铁还原微生物进行PCR-DGGE分析。测序结果见表2。在厌氧环境下，沉积物中有22个优势菌种，大部分属于δ变形菌门，主要是Geobacter(地杆菌属)，另外两个分别属于Chloroflexi(绿弯菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)。典型铁还原菌Geobacteraceae在沉积物中丰富，其中大部分优势种群与有机碳的转化和Fe(Ⅲ)还原相关[17-23]。

图4 不同处理对沉积物中CO2产生量的影响

表2 测序序列比对结果

沉积物中提供电子供体和电子受体对异化金属还原有重要影响。铁还原菌(IRB)作用下的异化铁还原反应对于控制沉积物中砷污染有重要意义，因此很多研究都对IRB在这个过程中的作用进行了探讨。基于前面研究发现厌氧条件下释放出来的砷的量要大于铁的量，有研究表明，砷吸附于饱和水铁矿，溶解1 mol Fe只能释放0.16 mol砷[24]。同时二价铁含量较低，由此推测矿区沉积物中可能还有能够直接还原As(Ⅴ)的微生物。所以分别考察了有机碳和Fe(Ⅲ)在厌氧条件下对沉积物中 Fe(Ⅲ)和 As(Ⅴ)还原微生物丰度的影响，以获得沉积物中砷释放的直接证据，结果见图5。

图 5不同处理下矿区沉积物中Geobacteraceae科微生物拷贝数

由图5可知，添加Fe(OOH)后，样品中Geobacteraceae科微生物拷贝数上升最多，加入乙酸钠后，样品中Geobacteraceae科微生物拷贝数也有增加，但没有加入Fe(OOH)多。说明三价铁作为电子供体对样品中Geobacteraceae科微生物富集的影响更明显。通过DGGE分析也发现添加Fe(OOH)后矿区沉积物中Geobacteraceae科微生物种类更多。这可能是由于铁胶颗粒较小，有些可能都是纳米级的，纳米颗粒的铁氧化物能促进微生物对铁的异化还原[25]，所以加入铁胶后促进沉积物中异化铁微生物的生长。但正是由于铁胶颗粒小，比表面积大，使得铁胶对砷有很强的吸附作用，所以迁移到水体的砷很少。铁胶虽然在生物方面有促进铁还原的作用，但非生物的物理吸附也不可忽视。总之，加入三价铁和乙酸钠后，对Geobacteraceae科微生物生长有明显促进作用，也再次证实Geobacteraceae科微生物活动对沉积物中砷的释放有重要影响。

通过砷的迁移转化数据研究发现，砷迁移出来的最高浓度为61.4 mg·L-1，换算迁移的量为73.7 mg·kg-1。而厌氧环境下铁最高迁移量是37.4 mg·kg-1。根据铁砷溶解释放比例(molar ratio As/Fe=0.16)折算，由于铁溶解释放砷的量只有8.0 mg·kg-1，远低于砷释放的总量，当然还有其他金属氧化物还原而引起砷的释放，例如锰氧化物。不过金属氧化物还原引起的砷的释放主要还是铁锰氧化物，因此推测此矿区沉积中砷的释放还存在其它关键释放机制，例如能够直接还原As(Ⅴ)的微生物。16s rRNA被广泛应用于对微生物多样性的检测。然而在微生物生态学中，物种鉴别并不一定与新陈代谢有关。另一种研究微生物活动的方法就是找寻功能基因。例如对硫还原菌(SRB)来说，大多数研究都致力于DSR片段的研究，这一成就被用于SRB在耐盐环境中的鉴别。同样的研究发现arrA功能基因是异化砷酸盐微生物(DARPs)还原As(V)可靠的标志[26]，因此利用功能基因引物arrAF4-arrAR4进行了PCR扩增，并对沉积物中异化砷酸盐的微生物丰度进行了荧光定量PCR分析，结果见图6。

由图6可知，添加乙酸钠后，沉积物中DARPs功能基因arrA拷贝数显著增加，而加入三价铁后略有增加，说明乙酸钠主要是富集DARPs。与前面荧光定量PCR分析Geobacteraceae科微生物相比，DARPs功能基因arrA拷贝数要高出一到两个数量级，说明DARPs相对丰度更高，意味着DARPs对矿区沉积物中砷的释放贡献更大。也就是说沉积物中除了Geobacteraceae科微生物对砷的迁移转化起作用外，起主要作用的微生物还有DARPs。陈铮等在研究几种含有醌类结构的电子中介体对沉积物中砷/铁迁移时发现，沉积物中砷/铁迁移到水体中主要是金属还原菌的作用，外源载体表面所含有的醌类结构及导电性是影响微生物胞外电子传递与砷/铁形态转化关系的重要原因[27]。

沉积物中砷释放机制既包括含砷铁氧化物的还原溶解[4]，还包括吸附的 As(Ⅴ)直接还原为 As(Ⅲ)。As(Ⅴ)的微生物还原机制主要分成两类：解毒和异化还原。As(Ⅴ)，由于结构类似磷，很容易通过磷的摄取蛋白进入细胞。微生物已经发展了一种解毒策略来保护自己免受As(Ⅴ)的毒害。例如，在有氧和厌氧环境下通过砷的耐受系统(ars)将 As(Ⅴ)还原为 As(Ⅲ)。有些厌氧微生物通过耦合As(Ⅴ)的还原和氧化有机碳获得能量。这些异化砷还原微生物在呼吸过程中以As(Ⅴ)作为最终电子受体。微生物还原砷能够增加砷的移动，因为As(Ⅲ)的移动能力比As(Ⅴ)更强。

图6 不同处理下矿区沉积物中砷arrA功能基因拷贝数

3 结论

本文在厌氧环境下，添加乙酸钠和Fe(Ⅲ)后微生物对沉积物中砷释放的影响，获得以下主要结论：

(1)矿区沉积物中砷的释放主要是微生物的作用，并伴随铁的释放；

(2)在厌氧微环境下，添加乙酸钠后，主要以As(Ⅲ)的形式释放到水体中，Fe(OOH)对砷有吸附作用；

(3)乙酸钠和三价铁对沉积物中的微生物都有明显富集作用，其中乙酸钠主要促进DARPs的生长，Fe(OOH)主要促进Geobacteraceae科微生物的生长；

(4)厌氧环境下沉积物中砷的释放是铁还原菌Geobacteraceae和砷还原菌DARPs共同作用的结果，其中DARPs起关键作用；

(5)在矿区沉积物中，富集的微生物中优势种属主要是由δ变形菌门、Chloroflexi(绿弯菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)所控制。