乳腺癌CTC与病理特征及预后相关性分析

阮国栋 王华 李志安

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，具有侵袭性、难治愈且易复发或转移的特点，严重影响妇女身心健康甚至危及生命。我国乳腺癌发病率的增长速度非常快、复发转移率高，乳腺癌的诊断和治疗依旧是一个研究热点［1］。影像学结合病理学检查是目前临床检测乳腺癌的主要手段，检测方法均具有创伤性和重复性低的特点，且在肿瘤达到特定大小或已发生转移时才能检测到，易错过最佳治疗期。循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）检测技术是一种实时无创的肿瘤诊断方法，操作简单，具有可重复性，已被用于包括乳腺癌在内的多个癌种的临床诊断［2-3］。在影像学发现微小转移灶之前，CTC 检测将成为检测乳腺癌转移及预后过程的有力工具。本资料将循环肿瘤细胞与乳腺癌的分期、分子分型进行综合研究，研究乳腺癌 CTC 的表达水平与患者临床病理特征以及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集于2016年1～5月期间在本院就诊的68例乳腺癌患者的临床资料，年龄48～80岁，平均（64.3±16.4）岁。肿瘤直径≥5cm者7例，＜5cm者61例；人表皮生长因子受体2（HER-2）阳性12例，HER-2阴性56例；TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期，Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期14例；乳腺癌分子分型，Luminal A型9例，Luminal B型40例，HER-2过表达型10例，三阴型 9例。纳入标准：（1）经穿刺活检技术确诊为乳腺癌；（2）均为初诊患者，且肿瘤为单侧、单发；（3）TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期，临床干预手段为手术治疗结合化疗；（4）无其他部位恶性肿瘤；（5）无炎症性乳腺癌、哺乳期乳腺癌或已行包块切除活组织检查。随访：从第1次诊疗后开始，以电话形式每隔 3 个月随访1次，共随访4年。达到随访时间、患者意外死亡或失联后终止随访。

1.2 CTC检测方法在手术后化疗前24h、辅助化疗结束后24h使用BD采血管采集患者的外周血液样本2份，每份7.5ml，室温保存并于24h内处理。室温条件下800g离心8min，弃掉上层血浆，保留至细胞层上5mm处。去除红细胞向离心管中加入3ml专用的密度梯度离心分离介质，缓冲液去除血浆的血样稀释后，缓慢平铺于离心介质上方。1050g离心8min。离心后缓慢取出采血管，将含白膜层的上层分离液全部转移至一个新的离心管。于上述去除红细胞的细胞悬液中加入适量的抗CD45的免疫磁颗粒，室温条件下孵育30～60min。将免疫磁珠孵育后的样本置于磁场下孵育5min，再将全部未结合磁珠的细胞悬液转移至一个新的离心管，则该离心管中的细胞为去除了绝大多数红细胞和白细胞的非血源性细胞。然后将富集后的细胞悬液，体积调整至100μl，加入同等体积的细胞固定液。缓慢吹打混匀后均匀涂于专用细胞防脱载玻片，于32℃过夜烘干。细胞涂片经润洗后，用CEP8探针进行原位荧光杂交，加入200μl 缓冲液配制的抗体（CD45-Alexa fluor 594，CK18）室温避光孵育2h，并用DAPI 荧光保存液封片，于正置荧光显微镜中立即观察细胞。根据CTC判读标准判定CTC细胞（CTC：DAPI+/CD45-/CEP8+，DAPI+/CD45-/CK+；WBC：DAPI+//CD45+/CEP8-/CK-）。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 18.0统计软件。计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验。生存分析比较采用Mantel-Cox检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC细胞鉴定 利用基于淋巴细胞表面抗原的CD45免疫磁珠进行外周血CTC的阴性富集，结合免疫荧光染色和原位荧光杂交（FISH）技术进行乳腺癌CTC的鉴定。将DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定为CTC细胞。见图1。

2.2 CTC与乳腺癌临床病理特征的关系 CTC与乳腺癌病理特征关系如表1所示，肿瘤直径＞5cm的患者与直径＜5cm患者相比中更易检测出CTCs阳性（P＜0.05）。乳腺癌患者CTC阳性率与肿瘤TNM分期显著相关（P＜0.05），TNM分期为Ⅰ期CTCs阳性率为16.7%，Ⅲ期为45.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同年龄、不同乳腺癌分子分型及HER-2表达与CTCs阳性无显著相关性（P＞0.05）。

表1 CTC与乳腺癌病理特征的关系［n（%）］

2.3 预后生存分析 根据患者化疗前CTC阳性情况，将乳腺癌患者分为CTC阳性组44例，CTC阴性组24例。其中CTC阳性组48个月生存率为37.12%，CTC阴性组48个月生存率为60.12%，CTC阳性组48个月生存率低于CTC阴性组48个月生存率，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。

图2 CTC 阳性和CTC 阴性患者生存曲线图

2.4 乳腺癌患者化疗前后CTC检测情况 化疗前68例乳腺癌患者中CTC阳性率为35.3%（24/68），化疗后CTC阳性率显著下降为19.1%（13/68），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

乳腺癌发病率现居女性恶性肿瘤首位，且发病率呈逐年上升趋势［4］。已有研究证实，CTC 对判断早期乳腺癌及转移性乳腺癌患者的预后均具有重要价值。常见CTC的富集包括流式细胞分选法、密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁珠富集法。由于膜过滤法和免疫磁珠分离方法的准确性较高并且无需较大样本量，因而在CTC检测中的应用更为广泛。基于淋巴细胞标志物CD45的免疫磁珠阴性富集的方法，灵敏性较高，对后续CTC鉴定所使用表面标志物的选择更为灵活。CTC阴性富集之后，利用CD45、CK染色和FISH检测实现CTCs的鉴定和分型。本资料中采用免疫磁珠分析方法分离CTC，将DAPI+/CD45-/CEP8+和DAPI+/CD45-/CK+判定为CTC细胞，在手术放化疗前，检测到24例患者CTC表达呈阳性，44例CTC表达呈阴性。

本资料结果中CTC阳性患者4年生存率为37.12%，CTC阴性患者为60.12%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此结果与梁志洪等应用膜过滤法检测CTC在乳腺癌预后与化疗评估中的结果相一致［4］。因此，本文实验结果进一步证实了CTC阳性患者生存期短，可用于预估乳腺癌患者预期生存率。进一步分析了CTC检出情况与病理的关系发现，乳腺癌患者CTC阳性率与肿瘤直径大小及肿瘤TNM分期显著相关（P＜0.05）。肿瘤直径＞5cm的患者与直径＜5cm患者相比中更易检测出CTCs阳性（P＜0.05）。TNM分期为Ⅰ期CTCs阳性率为16.7%，Ⅲ期为45.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）。而与患者年龄、乳腺癌分子分型及HER-2表达无显著相关性（P＞0.05）。因此认为HER-2阳性的乳腺癌患者不一定会检出CTC阳性，这与Ligthart等［5］报道相一致，该报道中HER-2阳性患者中29%呈现CTC阴性。本资料中68例乳腺癌患者化疗前CTC阳性率为35.3%，化疗后CTC阳性率显著下降为19.1%（P＜0.05）。此结果与江秋晨等［6］结果一致，进一步证实CTC检测可用于化疗期间疗效监测，还可用于评估化疗疗效及生存时间预测。

因此，对于治疗前CTC阳性而治疗后仍阳性的患者，可考虑适当强化化疗方案，也可作为对于HR阳性患者延长内分泌治疗的一个考量指标。同时本文样本量小，需要前瞻性、大样本、多中心的研究进一步验证。