自体软骨细胞移植技术治疗膝关节软骨缺损 11 例报告

王志学 姬振伟 徐奎 吴鹏 程世阳 丁勇

各种原因导致的膝关节软骨损伤发生率为5%，在特定人群中如运动员的发生率可高达 22%～50%[1]。人体膝关节软骨无血管组织、无血液供应，营养主要来源于关节腔内滑液，一旦损伤就很难再生，后期可能发展为骨关节炎[2]。因此膝关节软骨修复成为骨科医生最具挑战性的临床难题之一。膝关节软骨缺损的传统治疗方法包括关节镜下清理术、微骨折术、自体骨软骨移植术 ( 马赛克技术 )，但是这些方法各有其不足之处。关节镜下清理术只能暂时缓解临床症状，不能促进缺损区软骨修复。而微骨折术后再生的组织为纤维软骨，其耐磨性、生物力学性能和透明软骨相差很远，达不到真正意义上的软骨修复[3]。自体骨软骨移植术则存在供体受限、不适合大面积软骨缺损等问题，而且骨软骨栓之间的间隙可导致软骨退变[4-5]。随着医学技术的进步和组织工程的兴起，自体软骨细胞移植技术 ( autologous chondrocyte implantation，ACI ) 开始应用于临床。本研究应用 ACI 治疗创伤和剥脱性骨软骨炎导致的膝关节软骨缺损，采用 Lysholm评分、国际膝关节文献委员会 ( International Knee Documentation Committee，IKDC ) 主观评分和 MRI 对11 例进行术后最长 7 年随访。报告如下。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

1. 纳入标准：( 1 ) 年龄 18～55 岁；( 2 ) 膝关节急性或继发性软骨缺损患者；( 3 ) 缺损面积 2.5～8.0 cm2；( 4 ) 缺损程度 Outerbridge Ⅲ / Ⅳ 级。

2. 排除标准：( 1 ) 感染性关节病；( 2 ) 关节强直；( 3 ) 痛风；( 4 ) 传染性疾病 ( 肝炎、HIV、梅毒等 )；( 5 ) 糖尿病；( 6 ) 体质量指数 ( body mass index，BMI ) ≥ 30；( 7 ) 妊娠期患者；( 8 ) 下肢力线异常 ( 内翻或外翻超过正常值 5° )；( 9 ) 精神异常；( 10 ) 医生判定不能手术的其它情况患者。

二、一般资料

本研究纳入 2012 年 6 月至 2014 年 6 月于我科住院的 11 例膝关节软骨缺损患者，其中男 4 例( 36.36% )，女 7 例 ( 63.64% )，男女性别比为 0.57∶1；年龄 19～42 岁，平均年龄 ( 26.91±6.92 ) 岁。根据 Outerbridge 标准分级[6]，软骨缺损为 Ⅲ～Ⅳ 级，缺损面积 2.0～4.2 cm2，平均 ( 3.12±0.70 ) cm2，其中股骨外髁 6 处，股骨内髁 3 处，髌骨 2 处。3 例伴有初次髌骨脱位，3 例伴有半月板撕裂，1 例伴有色素沉着绒毛结节性滑膜炎。随访时间 5.3～7.5 年，平均 ( 6.46±0.79 ) 年。所有受试者均签署知情同意书，临床研究按照赫尔辛基宣言和中国伦理委员会要求进行。

三、手术方法

1. 术前准备：常规进行患膝关节正侧位 X 线片和 3.0 T MRI 检查，检测下肢力线和 Q 角，结合临床查体。如发现伴有髌骨脱位，半月板损伤，滑膜炎等合并症，则同时进行相应手术治疗。排除手术禁忌，术前进行 Lysholm 评分和 IKDC 评分。

2. 关节镜探查术：硬膜外麻醉下手术。气压止血带充气至 50～60 kPa。取膝关节前内、前外入路，镜下检查膝关节滑膜、内外侧半月板、前后交叉韧带以及髌股关节对应关系，如有损伤或病变进行相应处理 ( 3 例伴有初次髌骨脱位进行髌骨外侧支持带松解术，3 例伴有半月板撕裂进行半月板部分切除成形术，1 例伴有色素沉着绒毛结节性滑膜炎进行滑膜切除术 )。镜下探查明确膝关节软骨缺损具体部位和范围 ( 图 1 )。取关节非负重区健康软骨200～300 mg 作为种子细胞，送实验室 ( 陕西瑞盛生物科技有限公司 ) 进行自体软骨细胞制备。冲洗关节腔，缝合切口，手术完毕。

3. 移植物制备：超净工作台内使用磷酸缓冲盐溶液 ( phosphate buffer saline，PBS ) 反复清洗软骨碎片，Ⅱ 型胶原酶消化约 15～20 h。终止消化后依次进行离心、弃上清，并接种于培养皿置于恒温箱培养。定期观察软骨细胞生长、换液及传代。培养后约 6～8 周完成细胞计数和安全性检测，从培养皿底部机械分离软骨细胞移植物，制备完成。同时预约患者再次入院，准备手术移植。

4. 手术移植：硬膜外麻醉下常规消毒铺巾。再次关节镜探查软骨缺损区，撤关节镜后根据膝关节软骨缺损具体部位采用不同关节入路切开暴露关节缺损。同时将自体软骨细胞移植物浸入 0.9% 氯化钠溶液中备用 ( 图 2 )。缺损区清创至软骨下骨，修整缺损边缘。修剪自体软骨细胞膜片以匹配缺损形状，均匀覆盖于缺损区之后使用重组人纤维蛋白凝胶固定 ( 图 3 )。静置约 3 min，屈伸关节确定膜片无松动脱落。轻柔冲洗，依次缝合关闭切口。

5. 术后康复：术后佩戴可调节膝关节支具逐步进行功能康复锻炼。术后 48 h 内固定于伸膝位，术后 48 h 进行 0°～30° 之间主动屈伸膝活动，配合持续关节被动锻炼 ( CPM 机 )，同时进行股四头肌肌力恢复锻炼。逐步加大屈伸角度，术后 4～6 周开始部分负重活动，术后 12 周可去除支具。术后 1 年内避免对抗性体育活动。

四、评价指标

1. 术后 Lysholm 评分和 IKDC 评分：术前常规进行患侧膝关节 Lysholm 评分和 IKDC 评分。Lysholm评分分别于术后 3 个月、术后 2 年和末次随访时进行。从跛行、负重、交锁、关节不稳、疼痛、肿胀、爬楼梯、下蹲共 8 个方面对膝关节功能进行评估[7]。IKDC 评分同样于术后 3 个月、术后 2 年和末次随访时进行，通过调查问卷的形式调查患者的主观症状变化[8]。

图 1 患者，女，28 岁，关节镜下探查见股骨外髁软骨缺损伴有色素沉着绒毛结节性滑膜炎Fig.1 A 28-year-old female with femur lateral condyle cartilage defect and pigmented villonodular synovitis

图 2 自体软骨细胞移植物浸入 0.9% 氯化钠溶液中备用Fig.2 Autologous chondrocyte grafts were immersed in 0.9% sodium chloride solution for preparation

2. 术后 MRI 检查：术后 3 个月、术后 2 年和末次随访时分别进行患膝关节 MRI 检查，11 例均于空军军医大学唐都医院磁共振室完成 ( GE 公司，3.0 T )，之后交由磁共振室富有经验的医师进行术前术后不同时期的影像对比，进行软骨修复组织的磁共振观察 ( magnetic resonance observation of cartilage repair tissue，MOCART ) 评分，分别从缺损填充程度、移植物整合情况、修复区表面连续性、修复组织的内部结构、修复组织的信号、软骨下骨板情况、软骨下骨情况、关节是否粘连、关节积液或滑膜炎等方面进行系统评估[9]。

五、统计学处理

采用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析。对受试者基本资料和基线情况进行统计描述，计数资料用构成比表示，计量资料用表示。采用重复测量设计的方差分析，分别利用 Lysholm 评分、IKDC 评分和 MOCART 评分评价手术疗效。P< 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

所有患者均切口愈合良好，1 例合并色素沉着绒毛结节性滑膜炎术后康复依从性差，膝关节活动度恢复情况较康复计划滞后，术后 1 个月时经手法松解后逐渐恢复正常康复进度。所有患者未出现其它相关并发症和不良事件。所有患者均获得随访。

一、Lysholm 评分

采用 Lysholm 评分评价 ACI 对膝关节软骨缺损患者的治疗效果，结果显示，不同随访时间患者的 Lysholm 评分差异有统计学意义 (F= 89.874，P=0.000 ) ( 表 1 )。

图 3 a：软骨缺损区显露；b：缺损区清创；c：自体软骨细胞移植物覆盖Fig.3 a: Exposure of the cartilage defect; b: Debridement of the cartilage defect; c: Autologous chondrocyte graft implant

二、IKDC 评分

采用 IKDC 评分评价 ACI 对膝关节软骨缺损患者的治疗效果，结果显示，不同随访时间患者的 IKDC 评分差异有统计学意义 (F= 186.353，P=0.000 ) ( 表 2 )。

表 1 11 例膝关节软骨缺损患者 Lysholm 评分 ( 分 )Tab.1 Lysholm scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

表 2 11 例膝关节软骨缺损患者 IKDC 评分 ( 分 )Tab.2 IKDC scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

三、MRI 检查

患者术后 3 个月 MRI 检查显示：软骨缺损处基本填充，偶见局部混杂信号影，部分病例可见骨髓下水肿信号影，可见少量关节腔积液；术后 2 年软骨组织修复信号与周围正常组织接近，信号呈均匀一致样改变，骨髓水肿信号较前明显减退 ( 图 4 )；末次随访显示移植软骨与周围正常组织完全融合，骨髓下水肿信号影完全消失，关节面平整，无关节积液，与正常组织结构无差异 ( 图 5 )。

四、MOCART 评分

采用 MOCART 评分评价 ACI 对膝关节软骨缺损患者的治疗效果，结果显示，不同随访时间患者的MOCART 的评分差异有统计学意义 (F= 277.692，P= 0.000 ) ( 表 3 )。

表 3 11 例膝关节软骨缺损患者 MOCART 检查评分 ( 分 )Tab.3 Mocart scores of 11 patients with knee cartilage defect ( point )

图 4 a：术前，白色箭头显示股骨外髁软骨缺损；b：术后 2 年，白色箭头显示缺损区修复良好Fig.4 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: Good repair of the cartilage defect 2 years postoperation ( white arrow )

讨 论

图 5 a：术前，白色线头显示股骨外髁软骨缺损；b：术后 3 个月，白色箭头显示原缺损区初步填充，但仍可见轻微凹陷，信号不均匀；c：术后 7 年，白色箭头显示原缺损区修复良好，与正常结构无差别Fig.5 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: The defect was initially filled 3 months postoperation, but with slight sunken and uneven signals ( white arrow ); c: Good repair of the cartilage defect 7 years postoperation ( white arrow )

1987 年，瑞典医生 Peterson 最早应用 ACI 治疗膝关节软骨缺损。1994 年，Brittberg 等[10]报道使用 ACI治疗 23 例膝关节软骨缺损患者，缺损面积 1.6～6.5 cm2。术后随访16～66 个月 ( 平均 39 个月 )，所有患者的临床症状包括关节疼痛、肿胀、关节弹响均得到改善。当时该技术需取自体胫骨近端骨膜覆盖固定于关节表面缺损区，将含有自体软骨细胞的混悬液注入骨膜与缺损区的间隙，通过软骨细胞生长来修复软骨缺损。被称为第一代 ACI。随着应用日渐增多，第一代 ACI 显露出了很多缺点：细胞混悬液的渗漏、移植前软骨细胞去分化、软骨细胞在缺损区的不均匀分布等[11]。针对第一代 ACI 的不足，第二代 ACI 摒弃了常常导致胫前区疼痛及需要额外切口等术后并发症的自体胫骨骨膜，而采用 Ⅰ / Ⅲ 型双层胶原膜覆盖膝关节缺损区并注入软骨细胞混悬液。在一项对比研究中，第二代 ACI 术后效果明显优于第一代 ACI[12]。第三代 ACI 以生物材料作为软骨种子细胞载体，而不再需要骨膜或者 Ⅰ / Ⅲ 型双层胶原膜，也称为基质诱导的自体软骨细胞移植( matrixinduced autologous chondrocyte implantation，MACI )。一些研究报道了应用 MACI 技术治疗膝关节软骨缺损并获得了满意的临床效果[13-16]。

由于 MACI 技术通常选择藻酸盐或者透明质酸等作为支架进行软骨细胞嵌入[17]，技术要求高，治疗花费较大，所以限制了该技术在临床的进一步广泛应用，这也是 ACI 治疗膝关节软骨缺损术后长期效果报道相对较少的原因之一。本研究采用的自体软骨细胞膜片移植物不需要额外的生物材料作为支架，不含生物因子。相对于其它生物移植材料，可更大程度保证软骨细胞数目和活性。本研究纳入11 例膝关节软骨缺损患者采用 ACI 治疗并获得最长7 年随访，通过关节功能评分的提升和 MRI 表现证实了该技术临床效果满意。Brix 等[18]报道了 53 例接受 MACI 治疗的患者术后至少 5 年时间随访，结果显示效果良好；Filardo 等[19]对 131 例进行最短7 年时间随访，关节功能改善明显。上述研究中报道的 ACI 术后关节功能逐步改善和提升与本研究采用的软骨细胞膜片作为移植物术后结果基本一致，这一结果说明采用无生物支架材料的自体软骨细胞移植物修复膝关节软骨缺损后同样可以达到满意的临床效果，而且可避免生物材料降解和制备费用高昂等相应问题，这为膝关节软骨缺损的移植材料提供了新的选择。

本研究采用的 Lysholm 评分是国际公认的膝关节功能评分，更倾向于膝关节运动损伤的功能评估，与关节退变等因素基本无关，相对更适合本次临床试验的所有患者。Lysholm 评分从跛行、负重、交锁、关节不稳、疼痛、肿胀、爬楼梯、下蹲共8 个方面评分总和对膝关节功能进行评估，总分为100 分。本次试验所得数据显示 11 例在术后关节功能较术前明显改善，差异有统计学意义 (P< 0.05 )。IKDC 评分同样是全世界范围内应用最为广泛的评分系统之一，仅次于 Lysholm 评分。IKDC 评分主要对膝关节运动损伤患者进行关节功能评估。本研究采用的 IKDC 评分为 2000 年修订版，问卷简单易懂，更加注重患者主观感受。本研究显示所有患者术后的 IKDC 评分在术后逐步提升，差异有统计学意义(P< 0.05 )。

膝关节 MRI 是目前临床上评价关节软骨状况的最佳无创检查手段。本研究中 11 例均于术前常规进行 MRI 检查，术后 3 个月、术后 2 年以及末次随访时分别进行 MRI 检查。术后各时期 MRI 可见移植后原软骨缺损区逐渐填充修复，软骨恢复平整光滑形态。MOCART 评分逐步升高，差异有统计学意义(P< 0.05 )。Alparslan 等[20]详细描述了自体软骨细胞移植术后不同恢复阶段的 MRI 表现，笔者的研究中各阶段 MRI 表现与该作者报道一致。

本研究存在一些不足之处。首先，本研究纳入病例数不多。组织工程技术的快速发展促进了 ACI的更新换代，生物支架的不断改进以及软骨细胞成品移植物的层出不穷，使得应用单一技术产品治疗大量的膝关节软骨缺损患者比较困难。其次，本研究没有进行缺损区填充物的组织学检查。Marcacci等[13]应用 MACI 技术治疗 141 例膝关节软骨缺损患者，术后组织学检查大多是透明样软骨。张仲文等[14]对 10 例 MACI 患者进行为期 2 年的随访，并对部分患者行缺损区填充物活检，显示填充物为透明软骨和纤维软骨的混合体，以透明软骨为主。二次关节镜探查组织学检查如显示填充物为透明软骨或者类透明软骨，则对 ACI 的有效性更具说服力。但是本研究纳入患者术后关节功能恢复良好，无疼痛不适症状，因此所有患者无意愿接受再次手术探查。

综上所述，本研究结果表明，ACI 可有效治疗膝关节软骨缺损，术后关节功能评分显著提高，MRI 显示缺损区修复良好，长期随访效果满意。ACI操作简单，术后无明显并发症和不良反应发生。对于创伤原因导致的膝关节软骨缺损患者，尤其是年轻患者，是一项安全、可靠、有效的治疗手段。