3种中药制剂对肠炎沙门菌的体外抗菌和雏鸡感染试验

沈学怀，张丹俊，赵瑞宏，张庆贺，芮聪杰，潘孝成，胡晓苗

(1. 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031 ； 2. 安徽农业大学，安徽 合肥 230036)

多年来，由于抗生素在畜牧生产中的不合理使用，致使很多畜禽致病菌的耐药性逐渐增强，给畜牧业生产以及人类健康带来威胁[1-2]。随着国家对兽用抗生素的严格控制，寻找到替代抗生素用于畜禽细菌病治疗的中药单方或组方成为研究的热点[3]。中药具有多组分、多靶点和多作用的特点，其活性成分具有抗菌、抑菌活性，其毒副作用小且不易产生耐药性[4-5]。中药配方制剂的应用效果也显示了作为替代或联合抗生素在抗菌中的有效性和应用前景[6-7]。本试验就目前市售的3种中药制剂香连溶液、连蒲双清颗粒和高山大巴，开展对沙门菌的体外抑菌试验和雏鸡沙门菌感染保护试验，为中药防治家禽沙门菌感染提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物与菌株 本实验室孵化得到的7日龄SPF雏鸡120只。2株肠炎沙门菌，AH-22为药物敏感株，AH-27为多重耐药株，由安徽省畜禽疫病研究中心分离并保存。

1.1.2 试验药物与试剂 香连溶液、连蒲双清颗粒、高山大巴，均购自兽药市场；头孢噻呋钠，购自上海鑫牧源动物药业有限公司；LB琼脂平板、肉汤培养基、MM培养基和XLD4选择性培养基，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)和丙二醛(MDA)检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 供试菌液培养 沙门菌接种于肉汤培养基中，37 ℃振荡培养16 h，将菌液104倍稀释后作为体外抑菌试验的供试菌液。菌株AH-27涂板于LB培养基，37 ℃过夜培养，清洗菌苔并将菌液浓度配制为2×109CFU/mL，作为雏鸡攻毒的供试菌液。

1.2.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定 用营养肉汤培养液将香连溶液稀释为1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500；连蒲双清颗粒液稀释为16、8、4、2 g/L和1 g/L；高山大巴加入无菌水煮沸经纱布过滤后稀释为1.5、3、6、12 g/L和24 g/L；头孢噻呋钠稀释为6.25、12.5、25、50 mg/L 和100 mg/L，另设阴性和阳性对照，各管加入40 μL供试菌液。37 ℃震荡培养16 h，以试管清亮的药物最小稀释浓度作为该药物的MIC。取培养物划线于LB培养基，37 ℃温箱培养18 h，以无菌落生长的最小稀释浓度为药物的MBC。

1.2.3 试验分组 将雏鸡分为香连溶液组(1组)、连蒲双清颗粒组(2组)、高山大巴组(3组)、阴性对照组(NC组)和阳性对照组(PC组)，每组24只雏鸡。1、2、3组分别按香连溶液1∶300、连蒲双清颗粒4 g/L、高山大巴6 g/L加入饮水中，连用15 d，在用药后的第5天，1、2、3组和PC组口服接种供试菌液0.2 mL，NC组接种生理盐水。

1.2.4 指标测定与数据统计 记录各组死淘及病理变化，取雏鸡肝脏进行沙门菌分离，在不同阶段称量雏鸡体重，测各组血清中T-SOD、GSH-Px、LDH、ALT/GPT和MDA的含量。所有数据用SPSS16分析软件进行差异性统计分析。

2 结果

2.1 中药体外抑菌和杀菌试验 结果显示，香连溶液对2株沙门菌的MIC和MBC均为1∶300和1∶100；连蒲双清颗粒在试验浓度范围内未表现出体外的抑菌和杀菌作用；高山大巴的体外MIC均为24 g/L， 在试验浓度内无杀菌作用。头孢噻呋钠对药物敏感菌株的MIC和MBC分别为12.5 mg/L和50 mg/L，对多重耐药株无抑菌和杀菌作用。表明香连溶液和高山大巴对沙门菌体外抑菌不受菌株耐药性的影响。

2.2 中药对雏鸡感染肠炎沙门菌的保护性试验

2.2.1 雏鸡接菌后的剖检变化情况 在试验期内PC组和3组各死亡1只雏鸡，其他各组无死亡。组织病变和组织沙门菌分离率统计见表1。第5天 PC组在肝脏、心脏、脾脏、气囊、肾脏和肠道均出现不同程度的病变。与PC组相比，1、2组的组织病变减少，3组除肝脏病变多于PC组，其他组织病变与PC组相同或减少；3组的沙门菌分离率为90%，PC、1、2组的分离率均为100%。第10天，PC组心脏病变率为10%，肠道病变仍达到70%，1、3组肝脏病变率均为10%，中药组肠道病变率均低于PC组；PC组的沙门菌分离率为80%，1、2、3组的分离率分别为30%、40%和40%。

表1 不同时期各组剖检组织病变和组织沙门菌分离率Table 1 Necropsy tissue lesions and Salmonella isolation rate of each group in different periods

2.2.2 中药对雏鸡体重的影响 对不同阶段雏鸡进行体重称量(见表2)，在接菌前，各组之间的体重无明显差异。接菌第5天，NC组体重显著高于PC组，1、2、3组雏鸡体重均高于PC组，但未达到显著性差异(P>0.05)。接菌第10天，1、2、3组和NC组雏鸡体重均显著高于PC组(P<0.05)，其中1组和3组的平均体重甚至高于NC组。

表2 不同时间段不同组雏鸡体重变化Table 2 Changes in body weight of different groups of chickens in different time periods

2.2.3 中药对雏鸡血液应激损伤指标的影响 结果如表3所示，接菌第5天 NC、1、2、3组血清中LDH水平均低于PC组，其中NC、1、3组达到显著性水平(P<0.05)，其中1组最低，其次是3组和2组；在接菌后第10天 NC、1、2、3组LDH水平均略低于PC组，但都未达到显著性水平(P>0.05)。NC、1、2、3组ALT/GPT水平在第5天均显著低于PC组(P<0.05)，在第10天时的趋势相同，但仅3组达到显著性差异水平(P<0.05)。接菌第5天和第10天1、2、3组血清MDA水平均低于PC组，其中第5天 3组显著低于PC组(P<0.05)，第10天2组显著低于PC组和1组(P<0.05)。

表3 雏鸡血清应激损伤指标变化Table 3 Changes of serum stress injury indexes in chickens

2.2.4 中药对雏鸡血液抗氧化指标的影响 结果如表4所示，接菌第5天 PC组较NC组血清中T-SOD和GSH-Px均出现不同程度的降低，其中GSH-Px水平差异显著(P<0.05)；1、2、3组血清中T-SOD和GSH-Px水平均高于PC组，但并未达到显著性水平(P>0.05)。接菌第10天 PC组血清中T-SOD和GSH-Px水平均高于NC组，其中GSH-Px达到显著性水平(P<0.05)，1、2、3组血清T-SOD水平均高于PC组，但均未达到显著性水平(P>0.05)，1、2、3组血清GSH-Px水平在接菌后第10天均略低于PC组，但均未达到显著性水平(P>0.05)。

表4 雏鸡血清抗氧化指标变化Table 4 Changes of serum antioxidant indexes in chickens

3 讨论

近年来的研究表明，有些中药具有抑菌和杀菌作用，可作用于抗菌的多个环节，甚至逆转细菌耐药[8-9]。国内研究中药的学者相继发现多种中药成分具有抗菌的活性[10-11]。目前市售畜禽用中药多以复方制剂为主，本试验选用的3种畜禽用中药制剂均属于多组方中药。体外抑菌和杀菌结果表明，在试验浓度范围内香连溶液对沙门菌表现出体外抑菌和杀菌作用，高山大巴有一定程度的抑菌作用，连蒲双清颗粒无明显的体外抗菌作用。香连溶液和高山大巴对沙门菌的抑菌和杀菌作用与菌株的耐药性强弱无关，结果提示，中药制剂在治疗沙门菌耐药菌株感染时具有一定的应用潜力。

肠炎沙门菌感染可造成雏鸡的组织病理变化[12]、免疫器官指数降低[13]和血液淋巴细胞的下降[14]。本试验通过人工感染沙门菌评价3种中药对雏鸡的保护效果，结果显示，接种肠炎沙门菌可使雏鸡表现出肝脏、心脏、气囊、肠道等典型的感染临床症状和剖检病理变化。3种中药制剂不同程度的减少沙门菌感染导致的组织病变，在感染后期降低组织中沙门菌的分离率。3种中药制剂均可以提高由于沙门菌感染造成的体重减轻，甚至有一定的促生长作用。血清中LDH、ALT/GPT和MDA的含量可以反映机体的应激和损伤程度，而T-SOD和GSH-Px水平可反映机体的抗氧化能力。本试验结果显示，3种中药制剂均可降低LDH、ALT/GPT和MDA的血清含量，增加血清中T-SOD和GSH-Px水平，表明3种中药制剂均可减轻对感染雏鸡的机体应激损伤，提高机体的抗氧化能力，这也可能是中药组雏鸡感染后器官病变减少和增重未受影响的主要原因。