牛卵形巴贝斯虫病二温式PCR诊断方法的建立

田万年，王妍慧，薛书江，贾立军，张守发

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101 ； 2. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

牛的卵形巴贝斯虫病(Babesiaovata)是由巴贝斯科巴贝斯属的卵形巴贝斯虫寄生于牛红细胞内所引起的寄生虫病[1]。病牛多表现为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，多引起死亡[2-3]。我国于1986年在河南省卢氏县牛体内发现本病，随后1994年，在甘肃张家川回族自治县牛体内分离到卵形巴贝斯虫[4]。目前牛卵形巴贝斯虫的诊断主要通过血液涂片，显微镜检查为主，隐性感染牛的血液染虫率较低，显微镜检测易出现漏检和误诊。因此，急需建立一种敏感性高、特异性强，用于该病早期诊断。PCR方法是一种快速、敏感、特异的诊断方法，已广泛应用寄生虫病的诊断[5-6]。二温式PCR方法比常规PCR方法特异性更强，所需时间更少[7]。目前尚未见应用二温式PCR诊断牛卵形巴贝斯虫病的文献报道。本试验根据卵形巴贝斯虫18S rRNA基因序列设计1对引物，建立了二温式PCR方法，为今后牛卵形巴贝斯虫病的诊断和流行病学调查提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 血液样本采自吉林省珲春地区散养的延边黄牛60份，无菌采集抗凝血，用PBS洗3次。存于-20 ℃备用。同时制作了血液涂片，甲醛固定保存，供染色镜检。牛巴贝斯和双芽巴贝斯虫标准基因组DNA由日本带广畜产大学玄学南教授惠赠。瑟氏泰勒虫基因组DNA由延边大学预防兽医实验室保存。

1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2 000 DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 PCR诊断方法的建立

1.3.1 引物的设计与合成 根据GenBank上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA基因(LC125457)，利用Primer Premier 5.0软件在保守区设计了1对二温式PCR引物，引物P1：5′-TAGTTCTTAACCGACTTTC-TCG-3′，P2：5′-TTCTCAAGTAAAAATAGGCCC-3′，扩增预期片段大小为464 bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3.2 牛卵形巴贝斯虫DNA标准模板的制备 将经姬姆萨染色后显微镜检查确诊为牛卵形巴贝斯虫感染的抗凝血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，抽提的DNA用50 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.3.3 PCR扩增及退火-延伸温度的筛选 以提取的卵形巴贝斯虫DNA为模板，PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，62 ℃退火-延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。退火-延伸温度梯度为 58～64 ℃。

1.3.4 PCR产物的鉴定 将回收的PCR产物经纯化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司序列测定。

1.3.5 特异性试验 以卵形巴贝斯虫基因组DNA为试验样本，以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA为对照样本，进行二温式和普通PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.3.6 敏感性试验 用紫外分光光度计测定已提取的卵形巴贝斯虫DNA的OD260 nm值，计算DNA含量。以10倍为梯度进行连续稀释成7个不同浓度，按照最适退火-延伸温度进行二温式和普通PCR扩增，对比其敏感性。

1.4 临床样本的检测试验 应用所建立的二温式PCR方法对采自吉林省珲春地区的60份血液样品进行检测。同时，与常规PCR和血液涂片镜检相对比，比较阳性检出率。

2 结果

2.1 PCR扩增 对卵形巴贝斯虫基因组DNA进行PCR扩增后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，出现464 bp的特异性DNA条带(见图1)，与预期的片段大小相一致。

图1 卵形巴贝斯虫PCR扩增结果Fig. 1 PCR amplication result of Babesia ovataM：DL-2 000 DNA 标准； 1：卵形巴贝斯虫DNA样本； 2：空白对照M：DL-2 000 DNA marker； 1：Babesia ovata DNA； 2：Blank control

2.2 测序与序列比较 将PCR产物纯化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果表明，其核苷酸序列与GenBank上登录的牛卵形巴贝斯虫18S rRNA基因序列(LC125457)同源性为 99.9%。

2.3 退火-延伸温度的筛选 退火-延伸温度梯度为58～64 ℃。其中，60 ℃时目的条带最亮，因此，最佳退火-延伸温度为60 ℃(见图2)。

图2 退火-延伸温度的筛选试验Fig. 2 Screening test for annealing-extension temperatureM：DL-2 000 DNA标准； 1：58 ℃； 2：59 ℃； 3：60 ℃； 4：61 ℃； 5：62 ℃； 6：63 ℃； 7：64 ℃M：DL-2 000 DNA marker； 1：58 ℃； 2：59 ℃； 3：60 ℃； 4：61 ℃； 5：62 ℃； 6：63 ℃； 7：64 ℃

2.4 特异性试验 以牛卵形巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板，分别用二温式和三步法进行扩增，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果显示，仅牛卵形巴贝斯虫DNA样本扩增后出现特异性DNA条带，与预期片段大小相符，而作为对照样本的牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫基因组DNA均无此扩增条带出现(见图3)。

图3 特异性试验结果Fig. 3 The results of specific testM：DL-2 000 DNA标准； 1：卵形巴贝斯虫； 2：双芽巴贝斯虫； 3：牛巴贝斯虫； 4：瑟氏泰勒虫M：DL-2 000 DNA marker； 1：Babesia ovata； 2：Babesia bigemina； 3：Babesia bovis； 4：Theileria sergenti

2.5 敏感性试验 根据DNA分光光度法测定阳性模板DNA浓度为1.6×106fg/μL。将所取的DNA依次做10倍梯度稀释，分别进行PCR扩增，反应结果进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图4)。当DNA含量为16 fg/μL时，也能扩增出特异目的条带。

图4 敏感性试验结果Fig. 4 The results of sensitivity experimentM：DL-2 000 DNA标准； 1～8：1.6×106～0.16 fg/μL的PCR扩增产物M：DL-2 000 DNA marker； 1～8：PCR amplification products of 1.6×106～0.16 fg/μL

2.6 临床样本检测 对采自吉林省珲春地区60份血液样本分别进行二温式PCR方法、普通PCR和血液涂片检测。二温式PCR和普通PCR方法的阳性率均为30%(18/60)，2个检测方法检出结果差异不显著(P>0.05)，而血涂片阳性率为11.67%(7/60)，且血液涂片镜检诊断为阳性的样本经二温式PCR诊断均为阳性，表明二温式PCR方法更为敏感。

3 讨论

卵形巴贝斯虫是牛梨形虫病最为重要的虫种，严重制约养牛业的健康发展，急需建立一种快速的检测方法。目前卵形巴贝斯虫病PCR诊断方法目的基因为AMA-1和CCTη基因[8-9]。据报道，18S rRNA基因在梨形虫不同虫种间变异较大，但在同一虫种间具有较好的保守区域，是PCR诊断首选目的基因[10-11]。因此本试验以卵形巴贝斯虫的18S rRNA为目的基因，设计特异性引物，建立了卵形巴贝斯虫二温式PCR诊断方法，特异性试验表明，该引物只能扩增出卵形巴贝斯虫18S rRNA基因片段，而不能扩增出瑟氏泰勒虫、巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫基因组DNA，对该地区卵形巴贝斯虫病的临床诊断方面具有一定的应用价值。

本试验对所建立的二温式PCR各反应体系进行优化，比常规PCR退火温度要高，提高了检测特异性，PCR扩增时间明显缩短，提高了该病的诊断效率。对60份血液样本进行PCR检测，阳性率为30%(18/60)，而血液涂片染色镜检出的阳性率为11.67%(7/60)，二者检测的阳性符合率为100%。本试验所建立的二温式PCR方法为基层兽医部门对卵形巴贝斯虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种有效的检测方法。