猪蛔虫全基因组微卫星分子记开发与特征分析

何晶晶，黄建华，牛红艳，周春花，吴小平

(南昌大学生命科学学院，江西 南昌 330031)

猪蛔虫(AscarissuumGoeze，1782年)隶属于线虫纲蛔虫目，主要寄生于猪小肠，是生猪感染的最常见寄生虫之一，给养猪业造成巨大的经济损失[1]。同时猪蛔虫也可以感染人，危害人类健康[2]。因此，许多国家已将其纳入公共卫生学范畴[3]。微卫星标记又称短串联重复序列(Simple tandem repeat,STR)，广泛分布于原核和真核生物基因组中，由1～6 bp的重复单元串联而成，以双核苷酸重复最为常见[4]。与其他分子标记相比，微卫星分子标记因其存在广泛、数量多、分布均匀、多态性信息丰富、遗传共显性、具有较好的稳定性和重复性、易于检测等优点，成为目前遗传多样性和遗传结构研究中的首选标记之一[5]。但目前没有关于猪蛔虫的微卫星分子标记相关信息的报导。虽然有学者应用微卫星标记研究猪蛔虫，但这些标记都是基于其近缘种人蛔虫而开发[6-8]。近年来随着测序技术的发展，从全基因组水平研究物种的微卫星，一方面可以了解不同物种微卫星的生物信息学特征，另一方面可以揭示微卫星在遗传多样性等领域的应用[9-10]。因此，近年来基于全基因组开发微卫星分子标记受到研究者青睐。猪蛔虫全基因组测序已完成，其基因组微卫星分布规律也有报道[11-12]。本试验基于已公布的猪蛔虫全基因组数据，设计微卫星引物，验证其多态性，并进一步检测其在近缘种人蛔虫中的扩增情况，以期为猪蛔虫和人蛔虫的种群遗传研究、流行病学、宿主特异性、遗传结构、交配模式提供有价值的研究工具和分子标记资源。

1 材料与方法

1.1 材料 猪蛔虫采自抚州市孝桥屠宰场，收集了25头猪的肠内容物，共198条猪蛔虫。

1.2 DNA提取和PCR扩增 取猪蛔虫样本，剪下一小段体壁组织(约5 mm)用双蒸水洗去固定液(2～3 次)，剪碎，采用Wizard®SV Genomic DNA Purification System 试剂盒提取DNA。本试验猪蛔虫全基因组序列从美国国家生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载，然后使用软件MSDB v2.4.1搜索并统计微卫星序列，根据SSR侧翼序列的保守性使用Primer Premier 5.0设计引物，引物长度18～22 bp，GC含量在40%～60%，目的片段长度在100～400 bp。总共设计了104对猪蛔虫微卫星引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用上述104对引物进行PCR扩增，扩增体系为20 μL:PremixTaqVersion 2.0(TaKaRa)10 μL，上下游引物和DNA模板各2 μL，M-13FAM荧光标记引物1.6 μL，加水至20 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，先进性5个循环的高温PCR：94 ℃ 变性45 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，再进行30个低温循环：94 ℃变性45 s，退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR反应产物。

1.3 引物的筛选 104对微卫星引物均先用6个DNA样本扩增，能全部扩增出条带的引物即被初选。然后将初选得到的引物用于猪蛔虫种群的扩增(n=30)，琼脂糖凝胶电泳后，将有条带的扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行STR扫描。并将所有有多态性的引物用人蛔虫(n=6)扩增。

1.4 数据处理 根据扫描结果，利用CERVUS V2.0计算等位基因数(Number of observed alleles,NA)、观测杂合度(Observed heterozygosity,HO)、期望杂合度 (Expected heterozygosity,HE)和多态信息含量(Polymorphism information content,PIC)，利用Micro-Checker ver. 2.2.3计算无效等位基因频率(Frequency of null alleles,F)。利用Popgene1.32进行近交系数(Inbreeding coefficient,FIS)和哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)检测。

2 结果

2.1 遗传多态性分析 本试验基于猪蛔虫全基因组，根据微卫星侧翼序列的保守性共设计了104对引物，经扩增筛选共获得38对能稳定扩增并具有清晰条带的引物，经再次筛选后扩增成功的有28个位点，初步测试显示所有位点也能在人蛔虫中扩增(表中数据未显示)。在筛选到的28对引物中有25对具有多态性(表1)，扩增成功率26.9%。在25个有多态性的位点中，每个位点扩增得到的等位基因数(NA)在2～25个，平均8.2个；观测杂合度(HO)范围为0～1，平均值0.442；期望杂合度(HE)范围为0.042～0.945，平均值0.602；多态信息含量(PIC)范围为0.040～0.921，平均值0.558，其中有15个微卫星位点显示高度多样性(PIC>0.5)，5个位点显示中度多态性(0.5>PIC>0.25)，其他位点多态性较低(PIC<0.25)(表1)；无效等位基因频率范围为0～0.293 3，ASM46、ASM132、ASM213、ASM252、ASM535、ASM551、ASM573、ASM597、ASM598、ASM615、ASM632、ASM650这12个位点没有出现无效等位基因，其他位点均存在无效等位基因。

2.2 哈迪-温伯格平衡检测 Hardy-Weinberg检测显示，筛选获得的25个多态性位点中有15个符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)，有10个位点或多或少偏离哈迪-温伯格平衡(图1)。此外，通过Popgene1.32计算的FIS变化区间为-0.198 5～1，其中21个位点FIS>0(图1)。

图1 猪蛔虫微卫星位点的FIS值统计Fig.1 FIS value of microsatellite loci in A.suum注：负值表示杂合子过剩， 正值表示纯合子过量； *：偏离哈迪-温伯格平衡的位点(*:0.01

3 讨论

HWE检测显示，多数位点偏离哈迪-温伯格平衡。这与人蛔虫和Nicrophorusvespilloides开发的微卫星分子标记类似[6,13]，同时乌干达西南部人蛔虫的遗传多样性研究也出现了这种情况[14]，这很可能是蛔虫种群的普遍现象。而造成这种结果的原因可能是由于这些位点的纯合子过量或近亲繁殖，但也可能是由于这些标记物中存在无效等位基因引起的，此次试验也发现无效等位基因确实存在，而且无效等位基因存在的多数位点偏离HWE，其中ASM7、ASM69、ASM118、ASM168这4个位点显著偏离HWE(P≤0.001)，同时这些位点无效等位基因频率相比于其他位点也较高。由此推断无效等位基因的存在可能是导致偏离HWE的原因之一。

此外，FIS检测显示21个位点FIS>0，且多数位点观测杂合度小于期望杂合度，这与人蛔虫及其他线虫相似[6,15]，表现为杂合子缺失，种群个体间亲缘关系较近。试验结果表明，多数位点杂合子缺失，这种现象可能是由宿主内个体近交和/或Wahlund效应造成。而Criscione等在人蛔虫遗传多样性分析中也发现了杂合子缺失的多数位点也偏离哈迪-温伯格平衡，并解释这种现象可能是由于Wahlund效应，而非宿主内随机交配[6]。综上所述，本试验认为多数位点偏离哈迪-温伯格平衡可能是由无效等位基因和/或杂合子缺失造成的。

本试验基于已公布的猪蛔虫全基因组，进行了猪蛔虫微卫星分子标记的开发和特征分析，筛选获得了25个能稳定扩增并具有较高多态性的微卫星位点。这些标记可用于蛔虫遗传多样性、遗传结构、谱系鉴定和种间杂交等的研究。

表1 猪蛔虫25个微卫星位点特征描述Table 1 Characteristics of the 25 microsatellite loci for A. suum

续表1