马 璐 ,杨 驰 ,肖冬来 ,江晓凌 ,应正河 ,林衍铨 **
(1.福建省农业科学院食用菌研究所,福建 福州 350014;2.特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心,福建 福州 350014)
广叶绣球菌(Sparassis latifolia) 又名绣球菌、绣球菇、花瓣茸,隶属担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲 (Agaricomycetes) 多孔菌目 (Polyporales) 绣球菌科(Sparassidacea) 绣球菌属(Sparassis),是一种药食同源的大型真菌,近年来已成功实现工厂化栽培。绣球菌味道鲜美、营养丰富、富含多种生物活性物质,现代医学研究证实,绣球菌中的β-葡聚糖具有抗肿瘤[1]、调节免疫[2]等多种功效,可促进链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的伤口愈合[3],提高环磷酰胺所致骨髓造血功能受到抑制小鼠的造血功能[4]。因此,绣球菌是一种药食同源的健康保健食品。
食用菌菌种按形态特征可分为固体菌种和液体菌种,与传统的固体菌种相比,液体菌种具有培养菌种菌龄一致、制备周期短、便于机械化接种等诸多优势[5],已逐渐成为食用菌工厂化栽培菌种制备的发展方向。据统计,全国金针菇(Flammulina velu-tipes)产量前十位的企业均采用液体菌种,杏鲍菇(Pleurotus eryngii)固体菌种正在被逐渐替代,真姬菇(Hypsizygus marmoreus) 液体菌种也处于探索过程[6],平菇 (Pleurotus ostreatus)、香菇 (Lentinus edodes)、黑木耳 (Auricularia auricula) 等液体菌种生产技术也在迅猛发展[5]。
碳源与氮源是绣球菌菌丝生长过程中的重要营养物质,为了制备出优良的液体菌种,首先要对液体发酵培养基配方进行筛选。绣球菌液体培养的适宜碳源有葡萄糖[7]、麦芽糖[8]、可溶性淀粉[9]、玉米淀粉[10]、啤酒酵母、蜂蜜粉[11]等;最适氮源以牛肉浸膏[8]、蛋白胨[7]为主。目前关于绣球菌液体发酵的研究较多,但多数以提高次生代谢产物[8,12]或菌丝体生物量[7,10-11]为最终目的,真正作为液体菌种应用于大规模生产的研究却鲜有报道。前期试验结果表明,葡萄糖、鱼粉蛋白胨可作为绣球菌液体培养的适宜碳源及氮源[13],由于液体发酵过程中,当培养基碳氮比保持不变时,培养基中碳源与氮源的添加量可有较大变化。因此,液体发酵培养基应同时兼顾二者的比例及实际用量。
本试验在前期研究结果基础上,结合菌球形态特征,研究培养基中碳氮源比例及实际用量对绣球菌液体发酵的影响,以期为绣球菌液体菌种应用于工厂化栽培提供参考。
广叶绣球菌 (S.latifolia)(闽认菌 2013005),由福建省农业科学院食用菌研究所提供。
马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基(PDPA):马铃薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、鱼粉蛋白胨 2 g·L-1、琼脂粉16 g·L-1,pH自然。液体种子培养基:马铃薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、2 g·L-1鱼粉蛋白胨,pH自然。碳氮比试验基础培养基:KH2PO40.30 g·L-1、MgSO40.15 g·L-1,pH 自然。
1.3.1 菌种活化
绣球菌接种于PDPA培养皿上,24℃~25℃避光倒置培养20 d。
1.3.2 液体种子培养
从活化菌落边缘挑取直径7 mm菌块接种于液体种子培养基中(250 mL三角瓶,装液量100 mL),24℃~25℃,150 r·min-1避光培养10 d获得液体种子。
1.3.3 液体培养条件
采用250 mL三角瓶,装液量100 mL,灭菌后按8%(体积比)接种量接种液体种子培养基,24℃~25℃,避光,150 r·min-1振荡培养 15 d。
根据前期试验结果[13],以葡萄糖、鱼粉蛋白胨为液体发酵的碳源、氮源,在基础培养基中分别加入不同配比葡萄糖与鱼粉蛋白胨,观察绣球菌液体发酵效果,各处理重复3次,具体方案见表1。
表1 试验因素及水平Tab.1 Independent variable and their corresponding levels
培养结束后,采用pH计测定培养基pH。使用移液枪,从发酵液中随机吸取一定体积培养基,测定菌球个数;另将培养基中菌球排列成直线,测其总长度后获得菌球直径平均值。后用纱布过滤发酵液,将过滤后的菌球用清水充分冲洗,40℃烘干至恒重,电子天平称重测定菌丝生物量(W,%)。
式中:M为烘干的菌丝生物量(g);m为培养基中碳氮源的质量(g)。
试验数据采用 DPS(data processing system,Version7.05) 数据处理系统进行分析。
添加不同碳源、氮源液体发酵对绣球菌培养基pH、菌球直径及菌球密度的数据统计见图1。
图1所示,不同碳氮源组合中,液体发酵结束时,培养基终点pH在3.2~4.1之间,当保持碳氮源添加比例一定时,随着二者用量的增大,培养基发酵终点pH逐渐升高,菌球直径逐渐减小。当碳氮源添加比例为30:1时,菌球密度先升高后降低,最高为14.78个/mL。绣球菌液体培养效果见图2。
由图2所示,供试范围内,菌球直径、菌球密度相差不大。当碳氮源添加比例为10:1或50:1时,供试范围内随着二者添加量增大,菌球密度逐渐增大,最高分别为 11.0个/mL、12.2个/mL,但无显著性差异。
不同碳源、氮源比例下菌丝生物量见图3。
由图3所示,当葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为 10∶1、二者实际用量在 3∶0.3~9∶0.9 之间时,随着二者添加量的增大,菌丝体生物量逐渐升高,最高(3.56±0.32) g·L-1,达到显著性差异,随后菌丝体生物量逐渐减小。葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为30∶1时也有类似趋势,菌丝体生物量最高为(2.76±0.25) g·L-1。当葡萄糖和鱼粉蛋白胨添加比例为50∶1、二者实际用量为分别为12%和0.24%时,菌丝体生物量达到最大值 (2.23± 0.15) g·L-1,此后菌丝体生物量虽有减小,但与最大值无显著性差异。鱼粉蛋白胨添加量对绣球菌液体培养的影响见图4。
由图4可知,葡萄糖添加量在3%~9%之间、且葡萄糖添加量一定时,随着鱼粉蛋白胨用量的增大,菌丝体生物量逐渐升高,达到显著性差异。葡萄糖用量在12%~15%之间,随着鱼粉蛋白胨用量的增大,菌丝体生物量呈增大趋势,但无显著性差异。不同碳氮源组合下菌丝体生物量得率见图5。
由图5可知,在供试范围内,当葡萄糖用量一定时,随着碳氮比值的降低,菌丝体生物量得率逐渐升高,当葡萄糖用量3%,鱼粉蛋白胨用量0.3%时,菌丝生物量得率最高为8.6%。随着葡萄糖用量的增大,菌丝体生物量得率逐渐下降且趋于稳定。
液体发酵培养基可提供菌丝生长所需的各种营养物质,且适宜的营养比例可促进菌丝生长及次生代谢产物的积累。阿魏菇(Pleurotus ferulae) 液体发酵培养基碳氮比为20∶1时,菌球直径、菌球密度与菌丝球个数均达到最大[14];桑黄(Phellinus igniarius) 液体发酵碳氮比为20∶1~25∶1,菌球数量多且均匀,但对胞外多糖产量影响不明显[15],而适宜桑黄多酚、黄酮和甾醇的碳氮比为80∶1[16]。
绣球菌液体发酵时,当葡萄糖浓度较低时(3%~9%),随着鱼粉蛋白胨用量增大,菌丝生物量逐渐升高,且达到显著性差异,表明在一定范围内可通过调节培养基碳氮比来促进菌丝生长;前期研究结果也已证实,通过增加培养基中鱼粉蛋白胨含量来调节碳氮比,可促进菌丝生物量的提高[13];这也表明,培养基适宜的碳氮比可促进菌丝生长。当葡萄糖用量继续增大时(12%~15%),虽然仍可通过增加培养基中鱼粉蛋白胨用量来调节至适宜的碳氮比,但菌丝生物量增大趋势已趋于缓慢,无显著性差异,且单位营养物质下菌丝体生物量得率也呈现类似趋势。这也进一步说明,在提及培养基的碳氮比时,应同时考虑二者的实际使用量。
液体发酵过程中,为了达到最大菌丝生物量,可适当增加营养物质含量,但营养物质用量过量将导致培养基黏度及渗透压增大,最终影响菌球形态特征。试验结果中,保持培养基中碳氮源添加比例一定时,按比例增加二者实际使用量,菌球直径逐渐减小,达到显著性差异,菌球密度也有增大趋势,与阿魏菇的液体发酵过程类似[14]。因此,综合考虑培养基成本及发酵效果,适宜绣球菌液体发酵的葡萄糖用量为3%,鱼粉蛋白胨用量0.3%。
液体菌种培养过程中,除碳氮源之外,培养基pH、微量元素及生长因子、消泡剂等均会影响液体发酵效果,即使采用相同的培养基,发酵工艺不同时菌球活力也有差异。因此,在后续研究中,可进一步对上述因素进行探讨,为研发出高活力的绣球菌液体菌种提供参考。