不同临床类型慢性HBV 感染患者的血清HBVRNA 检测分析

徐振兴 ，黄利坚 ，王秀丽 ，滕菁 ，梁伟真

（福建省厦门市中医院1.检验科；2.肝病中心，福建 厦门 361009）

乙型肝炎病毒(HBV)严重威胁人类健康，目前对于HBV 的认识已取得较大进展。近年来的研究初步揭示了血清HBVRNA 的性质，提示其以病毒样颗粒形式存在与患者血清中，与肝细胞内cccDNA 存在相关性，可能反映抗病毒疗效等。但是血清HBVRNA 在慢性HBV 感染不同临床类型中的分布如何少有报道。本文旨在通过研究CHB 患者血清中HBVRNA 的检出情况，探讨血清HBVRNA的临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象 2018 年1 月至2019 年8 月在我院肝病中心诊治的住院及门诊患者,从中选取477 例资料完整的病例，按病因分为5 组,见表1,其中关于慢性 HBV 携带者、HBeAg 阳性 CHB、HBeAg 阴性CHB 和非活动性HBsAg 携带者病例的诊断符合慢性乙型肝炎防治指南(2015 更新版)[1]，CHB 治疗后HBsAg 阴转者的纳入标准为CHB 治疗后连续 2 次（至少间隔 3 个月）血清 HBsAg＜0.05IU/ml。

1.2 血清指标检测 空腹抽取患者静脉血5ml，一小时内分离血清,-20℃保存待测。实时荧光定量PCR 法检测血清HBVRNA, 检测系统为安普利GeneLight9800 核酸分析系统, 试剂为北京热景生物技术有限公司乙型肝炎pgRNA 检测试剂盒。严格按照试剂说明书进行操作。HBVRNA 的检测下限为300copies/ml，其检测有效性判定：每批次检测均用试剂盒自带阴阳性对照作为定性质控，阳性标本扩增曲线符合典型“S”形；定量标准曲线满足斜率在-3.0 和-3.5 之间以及 r2＞0.98。

表1 477 例病例分组情况

1.3 统计学方法 CHB 患者血清HBVRNA 阳性率与HBeAg、HBVDNA 阳性率的相关性分析及不同分组间HBVRNA 阳性率的比较采用χ2检验，HBVRNA 含量与HBVDNA 含量先分别进行Log10转换，再采用Pearson 相关作相关性分析。以双侧P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同CHB 患者血清 HBVRNA 阳性率 HBVRNA 阳性率从大到小排序为：HBeAg 阳性CHB组 55.5%(66/119)、 慢性 HBV 携带者组 42.2%(46/109)、 非活动性 HBsAg 携带者组 28.3%(32/113)、HBeAg 阴性 CHB 组 10.4%(11/106)以及 CHB 治疗后HBsAg 阴转者组6.7%(2/30)，总阳性率为32.9%(157/477)；各组间差异有显著性(χ2=66.48,P=0.000)。

2.2 血清 HBVRNA 阳性率与 HBeAg、HBVDNA 阳性率的相关性,见表2。HBeAg 阳性组的HBVRNA阳性率（49.1%，112/228）显著高于 HBeAg 阴性组（18.1%,45/249）（P=0.00）；HBVDNA 阳性组的 HBVRNA 阳性率（36.5%，124/340）显著高于 HBVDNA 阴性组（24.1%，33/137）（P=0.01）

表2 血清HBVRNA 阳性率与HBeAg、HBVDNA 的关系

2.3 血清HBVRNA 含量与HBVDNA 含量的相关性。在所有组别中,对 HBVRNA 与 HBVDNA 同时阳性的的数据进行Log10 转换后分析，结果表明它们之间存在一定的相关性（r=0.264，P=0.008）。见图1。

图1 血清HBVRNA 含量与HBVDNA 含量的关系

3 讨论

血清HBVRNA 成分已被证实为3.5kb 的病毒前基因组 RNA（pregenomeRNA，pgRNA），来源于未完全转录而遗留的pgRNA,也可能为核衣壳包裹的pgRNA 在未启动逆转录步骤的情况下直接获得包膜并从感染的肝细胞中释放出来,以病毒样颗粒形式存在[2，3]。基于核苷类似物（NAs）不能抑制 cccDNA 转录生成mRNA,理论上可以推断pgRNA 与cccDNA 水平相关,血清中HBVRNA 可以反映肝细胞内cccDNA 水平，因此已有较多的研究者认为血清HBVRNA 可作为潜在的NAs 治疗的新标记物，用以指导患者核苷和核苷酸类药物安全停药的指标等[4,5,6]。

我们对不同临床类型CHB 患者血清HBVRNA 的阳性率进行了调查, 发现HBeAg 阳性CHB组＞慢性HBV 携带者组＞非活动性HBsAg 携带者组＞HBeAg 阴性 CHB 组＞CHB 治疗后 HBsAg 阴转者组，各组间差异有显著性（χ2=66.48，P=0.000）。这一结果表明血清HBVRNA 与患者的免疫状态、HBV 的复制情况以及肝细胞内cccDNA 的转录活性有关,也提示在评估NAs 停药后复发风险方面值得深入研究[7,8]。

有研究结果表明HBeAg 状态可影响血清HBVpgRNA 与 cccDNA 的相关性，HBeAg 阳性患者的血清HBVRNA 水平与肝内cccDNA 呈显著相关，但HBeAg 阴性患者的血清HBVRNA 水平与肝内 cccDNA 无相关性[9]。本文 HBeAg 阳性组的 HB VRNA 阳性率(49.1%，112/228)显著高于 HBeAg 阴性组（18.1%，45/249）（P=0.00），提示血清 HBVRNA与HBV 的复制程度相关，同时进一步表明HBeAg阴性患者仍有可能存在病毒复制,具有较强的传染性。

本研究中，HBVDNA 阳性组的HBVRNA 阳性率 （36.5%，124/340） 显著高于 HBVDNA 阴性组（24.1%，33/137）（P=0.01），这一结果表明血清 HBVRNA 与HBVDNA 的联合应用能较好的反映慢性肝炎患者的HBV 感染状态。对于HBVDNA 阴性的血清而言，其检出的HBVRNA 可能是未参与转录而直接释放入血清的包被颗粒,也可能是抗病毒药物抑制了逆转录过程而后使得HBVRNA 释放入血。这需要对此类患者作较长时间随访检测来证实，但这也间接提示血清 HBVDNA 小于检测下限可能仅代表了病毒的逆转录过程被抑制,并不能反映 cccDNA 的转录状态，有转录活性的cccDNA仍会以 HBVRNA 病毒样颗粒的方式产生子代病毒。因此HBVRNA 可能作为较好的监测持续的病毒学应答及肝细胞核内 cccDNA 池的耗竭的潜在指标[10]。

本研究对HBVRNA 和HBVDNA 的血清浓度值进行Log10 转换后作相关分析，结果发现尽管它们之间存在一定的相关性(P=0.008),但相关程度较低(r=0.264)。这可能进一步提示血清HBVRNA 既可能来源于转录所剩的核酸颗粒 (与HBVDNA 一起反应HBV 的复制状态)，也可能是来源于阻断逆转录后的核酸颗粒(反应抗病毒的效果或停药的指标)。

综上所述,血清HBVRNA 可能与肝细胞内ccc DNA 转录活性有关,在抗病毒疗效的考核以及CH B 患者的临床管理方面有着一定的意义。本研究的局限性在于没有调查血清HBVRNA 与肝功能受损情况以及与HBcrAg、隐匿性乙肝的关系。