低温等离子体对粘盖牛肝菌菌丝生长的影响*

刘庆洪，李元慧，王艳琼，罗 瑞，王 鹏，田果廷

（1.中国农业大学园艺学院蔬菜系，北京 100094；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650221 3.中华全国供销全国总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

等离子体是一种导电流体，可以由任何中性气体在高压下电离为激发或未激发的分子、原子、自由电子、具有正负电荷的离子以及自由基等，整体呈电中性的状态[1-2]。低温等离子体可以影响酶的活性，修饰食品基质功能特性；降解毒素和农药；对农产品原材料进行灭菌等[3-4]。等离子体杀菌作为一种新兴的广谱灭菌技术，可以杀灭多种食品有害微生物，从而达到农产品保鲜保藏的目的[5-6]。研究中低温等离子体灭菌的原理是通过射频电源给过氧化氢一定的能量，让过氧化氢以等离子状态转变成活性基团；并与微生物体内的蛋白质和核糖核酸发生氧化反应，使细胞严重受损而死亡。研究发现等离子体除引起细胞在细胞结构（细胞膜、细胞壁的损伤）的伤害外，对遗传物质DNA也有一定损伤[7]。而在动物细胞试验中，等离子体对促进细胞增殖和诱导凋亡存在剂量效应，并会激活一些DNA修复信号通路[8]。等离子体产生的自由基还可以扰乱微生物的正常功能[9-10]。氩气、氧气、氮气经过放电处理后形成活性粒子，如氧原子、羟基自由基以及臭氧等。这些活性物质伴随其他成分一起作用于被处理物表面，发生一系列的生物、化学和物理反应，对被处理的微生物产生一系列的后果。

粘盖牛肝菌（Suillus bovinus），又名乳牛肝菌，是牛肝菌属（Boletus）中一种重要的食（药）用真菌[11]。粘盖牛肝菌味道鲜美，营养丰富，对糖尿病有很好的疗效，且有抗流感病毒、防治感冒的作用[12]；其子实体以及菌丝体的提取物具有抗癌活性，对小鼠肉瘤S180和艾氏癌的抑制率分别达到90%和100%[13]。粘盖牛肝菌等菌根菌不能人工栽培，合理开发利用菌根型食用菌资源，菌丝体培养是开发利用的先决条件[14]；用菌丝体代替粘盖牛肝菌子实体在食品和医药方面的应用已越来越受到人们的重视[15-16]。通过以低温等离子体处理粘盖牛肝菌的菌丝体，探讨其对粘盖牛肝菌菌丝生长发育的影响和效果，为粘盖牛肝菌的生长发育条件的探索和完善提供一定的试验研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

粘盖牛肝菌（Suillus bovinus） 菌株，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所收集、分离、纯化和鉴定。标本号2018CX065，保存于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所资源库。

粘盖牛肝菌菌丝体分离、纯化和培养的母种培养基采用PDA。菌丝体培养基采用：玉米粉4.0%、麸皮5.0%，磷酸二氢钾0.10%、硫酸镁 0.05%、琼脂1.20%。最适培养条件为：培养基pH 6.0，培养温度28℃，在此培养条件下，粘盖牛肝菌菌丝体生长良好[17]。

1.2 仪器与试剂

等离子发生器由北京大学自主研发，提供给本项目研究使用；PD培养基和MMN培养基购自美国碧迪医疗器械有限公司。常规试剂购自国药集团。

1.3 不同电流、电压下低温等离子体对粘盖牛肝菌生长的影响

将粘盖牛肝菌的菌丝碎片接种于MMN培养基（pH 4.2） 上，培养温度为28℃～30℃，避光培养。待菌落直径约为1.5 cm时进行不同电压、电流下等离子体的处理，再继续进行培养。

1.4 理想电压、电流下不同时间的等离子处理对粘盖牛肝菌生长的影响

在理想电压、电流条件下，设计不同处理时间 （0、0.5 min、1 min、2 min、3 min），对菌落达到1.5 cm的粘盖牛肝菌菌落进行处理。将处理后的粘盖牛肝菌置于28℃～30℃下避光培养，观察试验结果。

2 结果分析

2.1 不同电压、电流大小低温等离子体对粘盖牛肝菌生长的影响

不同电压、电流下低温等离子体作用对粘盖牛肝菌生长的影响情况统计见表1。

表1 不同电压电流条件下低温等离子体处理对粘盖牛肝菌的生长情况的影响Tab.1 Effect on growth of Suillus bovinus by non-thermal plasma treatment under different voltage and current conditions

表1结果显示，处理时间对于粘盖牛肝菌的生长情况影响最大，电压在0.35 kV、电流为0.25 A处理2 min，促进菌落生长效果最佳。

对所得结果打分以利于分析，设定“不明显”为0分，“微弱抑制作用”为-1分，“微弱促进作用”为1分，“促进作用”为2分，“抑制作用”为-2分。赋值结果填入表并对结果进行极差分析如表2所示。

由表2可以看出，处理时间的极差最大，表明处理时间对于粘盖牛肝菌的生长情况影响最大。结果还表明，只有处理的电压达到了有效最高点（1分），电流和时间都未达到有效最高点。可以确定，电压在0.35 kV时最有效。

当电压在0.35 kV时，电流大小对牛肝生长状况的影响有一个时间效应，即当处理时间较短时（2 min） 时表现为促进作用，在处理时间较长（5 min）时表现为抑制作用。这表明在电压在0.35 kV、电流大小0.25 A时，粘盖牛肝菌的生长有一个最佳促进时间点。

表2 不同电压电流条件下低温等离子体处理对粘盖牛肝菌生长影响的极差分析Tab.2 Range analysis of Suillus bovinus growth by non-thermal plasma under different voltage and current

2.2 理想电压、电流下不同时间的等离子处理对粘盖牛肝菌生长影响的结果

理想电压、电流下不同时间的等离子处理对粘盖牛肝菌生长影响结果见表3和图1。

表3 定压定流下低温等离子体不同处理时间对粘盖牛肝菌生长的影响Tab.3 Growth affection of Suillus bovinu by non-thermal plasma under different time with same voltage and current

表3和图1结果显示，处理0.5 min对粘盖牛肝菌有微弱的促进作用，1 min处理促进作用略强于2 min处理时间，3 min处理时已无促进作用。

低温等离子体发生器电压电流参数设置为电压0.35 kV、电流0.25 A条件时，处理时间小于1 min，随着处理时间的延长，低温等离子体对粘盖牛肝菌的生长促进作用逐渐明显或变强。

低温等离子体发生器电压0.35 kV、电流0.25 A条件时，当处理时间超过1 min，低温等离子体处理对粘盖牛肝菌的促进生长作用开始变弱，处理时间3 min促进效果接近消失。

3 讨论

对粘盖牛肝菌的甲醇提取物抗氧化试验表明，粘盖牛肝菌具有较强的还原力和抗脂质氧化作用，并有一定的自由基清除能力[18]。同时粘盖牛肝菌多糖的抗氧化性试验也表明，粘盖牛肝菌的多糖具有较强的氢氧自由基和氧负离子自由基的清除作用[19]。由于粘盖牛肝菌菌丝具有较强的还原力和脂质抗氧化作用，并有一定的清除自由基的能力，在低温等离子体对粘盖牛肝菌菌丝处理过程中，在稍短的时间中，粘盖牛肝菌菌丝对低温等离子体产生的氧化性伤害具有一定抗性，甚至加速其菌丝的生长[20]。

低温等离子体对粘盖牛肝菌菌丝生长的效应可能基于以下原因。1）紫外射线效应：大量紫外射线会在低温等离子体产生过程中被放出。短时的紫外线照射有助于粘盖牛肝菌菌丝的生长，而大量的紫外射线会破坏DNA等核酸物质，从而对粘盖牛肝菌菌丝生长起到一定的抑制作用[21]。2）活性自由基和粒子的作用：在氧化性气体等离子体中，含有大量自由基（如NO·）。特定的自由基（NO·） 在低浓度下会作用于细胞代谢，促进粘盖牛肝菌菌丝生长；高浓度则会对其菌丝生长不利[22]。

利用各种不同的高压电源和反应器，可以产生性状特异的多种低温等离子体。这些等离子体与不同种类生物的细胞相互作用时会形成多种生物学效应，如致死和亚致死效应，在不同的领域得到广泛的应用[23]。在本试验研究中，由于电压0.35 kV和电流0.25 A的值比较小，在时间较短的情况下（如1 min），高速粒子穿透效应和电场效应的作用并不是最重要因素，此时紫外射线和活性自由基起主要作用。粘盖牛肝菌具有较强的抗氧化、清除自由基作用。此试验条件下短时间内低温等离子体对粘盖牛肝菌菌丝的损伤作用不明显，反而却由于其他一些目前未知的原因促进了粘盖牛肝菌菌丝的生长。低温等离子体对粘盖牛肝菌菌丝生长的促进作用有待进一步研究和探索。当处理时间变长后，各种损伤效应开始累积。促进粘盖牛肝菌菌丝生长作用渐变成抑制生长作用，进而随着损伤的加剧，导致菌丝体细胞的死亡，使牛肝菌生长受到严重的抑制。低温等离子体与菌根菌细胞之间的相互作用机理，以及相关等离子体技术的开发，会是低温等离子体影响粘盖牛肝菌等菌根型食用菌人工培养的一个研究方向。