等离子处理对碳微球在MALDI-TOF-MS基质效应研究

赵亚男， 孟龙月，b， 金 彪，c

（延边大学a.理学院化学系；b.地理与海洋科学院；c.分析测试中心，吉林延吉133002）

0 引 言

近年来，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）由于其软电离、高通量、质量检测范围宽、准确度高、灵敏度高、耐盐度高、样品需求量少、分析速度快等优点被广泛应用于蛋白质、多肽、多糖、寡核苷酸及氨基酸等生物分子检测领域［1］。在MALDI-TOF-MS检测过程中，基质起着举足轻重的作用，不仅可以提高待测分子的分散度，并且能吸收激光能量，转化为待测分子的激发能，从而使待测分子在MALDI-TOF-MS中被电离及检测。常见基质主要分为有机基质［2］与无机基质，其中，金属材料、沸石材料及半导体材料［3-4］等无机基质由于离子化效率高、结晶均匀等优点被广泛应用于生物分子物质的检测。然而，金属材料价格昂贵，且制备过程复杂，半导体材料实用性差，沸石材料性能不稳定等缺点使得MALDITOF-MS检测生物分子存在一定的局限性。

近年来，碳材料因其优良的电子转移能力和较强的激光能量吸收能力，良好的化学稳定性，不易与生物分子发生反应等特性在MALDI-TOF-MS 检测生物分子领域备受关注［5-7］。碳微球作为一种小尺寸碳材料，由于其低成本、良好的导电性及小尺寸效应等优点使得作为基质在检测生物分子领域得到进一步拓展［8］。然而，碳微球表面官能团类型杂乱，粒径大小不均匀，致使其在溶剂中分散性较差、结晶困难［9］。为了提升碳微球性能，科研工作者们通常采用元素掺杂、活化处理和等离子处理等方式对碳微球形貌、粒径和表面官能团进行优化［10］。其中，碳材料经过等离子处理后，材料粒径尺寸更加均匀，氧元素含量及表面粗糙度显著增加，在催化、电容器、电池等领域具有显著的影响［11-12］。本文通过对碳微球进行等离子改性，碳微球表面—COOH、—OH 及—C ＝O 等含氧官能团不仅增大碳微球在溶剂中的分散性，同时也增强碳微球与亮氨酸的结晶能力，可有效保护样品分子不受损坏，从而提高作为MALDI-TOF-MS 基质检测生物分子的能力。本文将聚吡咯基碳微球（PPy-CMSs）与碳黑基碳微球（CB-CMSs）作为MALDI-TOF-MS 基质对亮氨酸进行检测，考察在不同等离子处理时间、溶剂及浓度下，碳微球作为基质效果的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（AXIMACFRTMplus 岛津公司）；K1050X 等离子灰化仪（Emitech Ltd）；真空／气氛管式电炉（天津市中环实验电炉有限公司）；5700 型红外光谱仪（美国尼高力）；扫描电子显微镜（SEM SU8000，日本日立高新技术公司）；乙腈（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；乙醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，北京化工厂）；去离子水（Millipore 纯水系统）；亮氨酸（分析纯，上海康达氨基酸厂）；六水三氯化铁（分析纯，天津市光夏科技发展有限公司）；吡咯，碳黑均购自Sigma。

1.2 碳微球的制备

配置0.5 mol／L六水三氯化铁水溶液400 mL，将6.2 mL吡咯单体（Py）滴加进溶液，搅拌2 h使其完全反应。经过抽滤、去离子水洗涤至中性，烘干12 h 后研磨成粉末备用，命名为PPy-1，将PPy-1 采用真空／气氛管式电炉中（程序升温为5 ℃·min－1）碳化制备PPy-CMSs。

1.3 等离子处理碳微球

K1050X等离子灰化仪：腔室压力0.1 kPa，真空度1 mPa，工作功率70 W，13.56 MHz，氮气（N2）为保护气，氩（Ar）气流量为20 cm3／min 状态下，分别将PPy-CMSs、CB-CMSs进行不同时间等离子处理（0，1，3，5，7，10 min），样品分别编号为PPy-CMSs-0，PPy-CMSs-1，PPy-CMSs-3，PPy-CMSs-5，PPy-CMSs-7，PPy-CMSs-10；CB-CMSs-0，CB-CMSs-1，CB-CMSs-3，CBCMSs-5，CB-CMSs-7，CB-CMSs-10。

1.4 分析条件

MALDI-TOF-MS：采用AXIMA-CFRTMplus N2激光源，发射波长为337 nm。负离子反射模式，加速电压20 kV，扫描范围为m／z 100 ～2 000，每张质谱图由总激光发射脉冲次数为50 的质谱图平均累计产生。数据采集前，用马心肌肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作为标准物，校正仪器的绝对准确度至0.1 Da。将碳微球溶液超声20 min，亮基酸溶液与碳微球溶液按照体积比V亮氨酸∶V基质＝1∶2，以基质覆盖待测物方式在靶板点样，自然干燥，通过MALDI-TOF-MS 负离子模式进行检测。

2 结果与讨论

2.1 SEM分析

碳微球SEM分析见图1。由图可看出，碳微球未经等离子处理前粒子形貌分布不规则，形状无规律，且团聚程度高（图1（a），（c））。碳微球经过等离子改性后，颗粒外形呈规则球状，分散性明显增加（图1（b），（d））。等离子处理后，两种碳微球（0.1 mg／mL）均匀分散在溶剂中，呈墨汁状，无分层现象，溶剂中分散性明显提高，增大了基质与检测样品的共结晶性能。

图1 碳微球扫描电镜图

2.2 红外光谱分析

碳微球红外光谱分析见图2，由图可以看出，碳微球存在—OH弯曲伸缩振动峰（PPy-CMSs 与CB-CMSs红外吸收峰分别为3 445、3 441 cm－1），—C ＝O 羰基伸缩振动峰（PPy-CMSs 与CB-CMSs 红外吸收峰分别为1 645、1 639 cm－1），—C ＝O羧基伸缩振动峰（PPy-CMSs与CB-CMSs 红外吸收峰分别为1 715、1 719 cm－1）。结果表明，碳微球表面含有羟基、羧基、羰基等含氧官能团，含氧官能团的存在可以显著提高碳微球在溶剂中的分散性，增大了与氨基酸的共结晶能力。

图2 PPy-CMSs-5和CB-CMSs-3红外吸收光谱图

2.3 碳微球作为MALDI-TOF-MS基质条件

2.3.1 碳微球空白对照实验

PPy-CMSs-5、CB-CMSs-3 基质背景检测结果见图3 中a、k。由图可以看出，在m／z 100 ～600 Da 区没有出现大量基质相关裂解峰和杂质峰，大大减少了基质对该区域分析物的干扰，符合小分子质谱检测要求。

图3 在不同等离子处理时间和不同溶剂中，PPy-CMSs与CBCMSs基质对亮氨酸的检测

2.3.2 等离子处理时间对亮氨酸检测的影响

基质与亮氨酸浓度均为0.1 mg／mL，去离子水为溶剂，PPy-CMSs 经过不同等离子时间改性作为MALDI-TOF-MS基质对亮氨酸检测，结果见图3 中b～f。图中离子信号离子峰显示，当等离子处理时间为1、3、5、7 和10 min时，［Leu-H］－特征峰强度随着等离子处理时间变化呈正态分布，处理5 min 时，［Leu-H］－特征峰强度最大，且背景峰最少。CB-CMSs 经过不同等离子时间改性作为MALDI-TOF-MS 基质对亮氨酸检测，结果见图3 中l ～p，当CB-CMSs 经等离子处理3 min 时，［Leu-H］－特征峰强度大，且背景峰最少。

综上所述，等离子改性时间不同造成碳微球表面官能团含量差异，造成碳微球分散性及与亮氨酸结晶解吸效果改变，极大影响碳微球作为MALDI-TOF-MS基质对亮氨酸检测能力［13-14］。因此，本实验最佳等离子改性时间为5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs）。

2.3.3 不同溶剂对亮氨酸检测的影响

基质与亮氨酸浓度均为0.1 mg／mL，当PPy-CMSs等离子改性时间为5 min，PPy-CMSs在不同溶剂（水、乙醇、甲醇、乙腈）中对亮氨酸检测结果见图3 中g ～j。乙醇作为PPy-CMSs溶剂时，［Leu-H］－特征峰强度最大，明显高于其他3 种溶剂时的特征峰强度。当CB-CMSs等离子改性时间为3 min，CB-CMSs 在不同溶剂（水、乙醇、甲醇、乙腈）中对亮氨酸检测结果见图3 中q ～t。去离子水为CB-CMSs溶剂时，［Leu-H］－特征峰强度明显高于乙醇、乙腈及甲醇作为溶剂时的特征峰，且背景干扰最小。

结果表明，碳微球由于表面—COOH、—OH 等官能团的影响，在不同极性溶剂中分散性不同，与氨基酸共结晶能力差异较大［15］。综上所述，实验确定最佳溶剂为乙醇（PPy-CMSs）和去离子水（CB-CMSs）。

2.3.4 不同基质浓度及亮氨酸浓度对检测的影响

去离子水为溶剂，亮氨酸浓度为0.1 mg／mL，等离子改性时间为5 min（PPy-CMSs）和3 min（CB-CMSs），不同碳微球浓度对亮氨酸检测结果见图4 中a ～i（PPy-CMSs）和m ～u（CB-CMSs）。当碳微球浓度为0.02 ～0.10 mg／mL时，如图4 中a ～e（PPy-CMSs）和m ～q（CB-CMSs）所示，［Leu-H］－特征峰强度随碳微球浓度的增大而增大。当碳微球浓度为0.20 ～0.50 mg／mL 时，如图4 中f ～i（PPy-CMSs）和r ～u（CBCMSs）所示，基质背景离子峰明显增多，未知来源的碎片）峰以及基质加合分子离子峰严重影响亮氨酸特征峰强度，无法对质谱进行准确解析。

图4 PPy-CMSs与CB-CMSs对亮氨酸检测

碳微球对不同浓度亮氨酸（10，0.1，0.01 mg／mL）检测结果见图4 中j ～l（PPy-CMSs）和v ～x（CBCMSs）。图中离子信号离子峰显示，两种基质均顺利检测出［Leu-H］－特征峰。初步确定了亮氨酸的检测限度为0.76 nmol／mL。

结果表明，碳微球浓度过低导致检测信号偏弱；浓度过大，溶剂分散性降低，发生团聚现象［16-17］。综上所述，PPy-CMSs、CB-CMSs最佳浓度为0.1 mg／mL。

3 结 语

通过等离子表面处理法改变了PPy-CMSs 及CBCMSs的表面化学结构，两种碳微球作为飞行质谱的新基质成功对亮氨酸进行检测与分析。该检测方法简便，材料廉价易得，实验过程污染小，可控性及重现性良好。该研究拓宽了MALDI-TOF-MS 检测中基质种类范围，有望推广到其他生物小分子检测之中。