降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定与益生特性评价

郑志瑶，王伟军，陈 波，刘建新，任大喜*

（1 浙江大学动物科学学院奶业科学研究所 杭州310058 2 浙江一鸣食品股份有限公司 浙江温州325000）

根据WHO 统计，心血管疾病（CVD）是目前全球人口的主要死因之一，每年造成1 700 多万人死亡[1]。近年来国内外大量临床和动物研究表明，服用乳酸菌，特别是乳杆菌及其相关制品具有减少血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效[2-3]。乳酸菌（LAB）在自然界中广泛存在，是发酵工业中不可缺少的微生物。诸多研究也报道了其作为益生菌对人体健康的促进作用，包括：免疫调节、减轻乳糖不耐受、预防结肠癌和减少过敏反应[4-6]。1974年，Mann 等[7]最早发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的潜力，这引起国内外研究人员对乳酸菌及乳制品在防治CVD 方面的关注。植物乳杆菌299v[8]能显著降低高胆固醇血症患者血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。肖琳琳等[9]用菌株KM-166 灌胃高脂血症小鼠，显著降低了血清中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。Wang 等[10]分离到1 株植物乳杆菌LIP-1，体外降胆固醇能力为71.47 μg/mL，同时能显著降低大鼠血清TC 和LDL-C 水平。

益生菌（Probiotic）是一类在宿主体内以一定数量存活并发挥有益作用的微生物。人体内胃肠道中的酸和胆盐环境能抑制微生物的生长，潜在的益生菌应具有酸和胆汁的耐受性，这是菌株在小肠中生存及发挥益生作用不可或缺的因素[11]。微生物的抗生素敏感性测定对评价菌株安全性具有重要意义。只有不具备耐药性的菌株用于人体才是安全的。此外，部分乳酸菌在生长过程中产生的代谢物，能抑杀肠道中的致病菌，调节肠道菌群平衡。对于体外筛选降胆固醇乳酸菌来说，对菌株的益生特性评价是不可缺少的环节。只有具备了益生菌最基本条件的菌株，才能开展体内研究。

本研究中在体外筛选高效降胆固醇的乳酸菌，对其酸耐受性、胆盐耐受性、抗生素敏感性及代谢产物的抗菌活性进行评估，为后续体内研究及功能性乳制品开发提供具有益生潜力的菌株。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

样品来源：从吉林延边朝鲜族自治州农户采集了8 个传统发酵泡菜样本；浙江金华地区金华火腿食品厂采集了4 个火腿样品；婴儿粪便采集自浙江杭州20 个未满1 岁的母乳喂养的健康婴儿。

阳性对照菌株：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC 43121，购自美国典型培养物保藏中心。

指示菌株：大肠杆菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）ATCC 25922和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 13311，购自美国典型培养物保藏中心；单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC 54007 和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003，购自中国医学细菌保藏管理中心。

水溶性胆固醇（细胞培养级），美国Sigma-Aldrich 公司；胆盐（生化试剂）、MRS 肉汤培养基和琼脂培养基（生化试剂）、抗生素药敏试纸（生化试剂），均购自杭州微生物试剂有限公司；LB 琼脂培养基（生化试剂），北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA 抽提试剂盒（生化试剂），生工生物工程（上海）有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7980A 气相色谱仪，美国Agilent 公司；3-30K低温高速离心机，德国Christ 公司；MD200-2 氮吹仪，郑州南北仪器公司；ES-315 高压灭菌锅，日本Tomy 公司；JEM-1230 透射电子显微镜，日本电子株式会社；SW-CJ-IF 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离 取1 g 样品放入9 mL 的MRS 液体培养基中，涡旋混匀后于37 ℃下富集培养48 h。然后吸取富集液1 mL，用无菌生理盐水进行10 倍梯度稀释，选取合适的3 个稀释梯度，每个梯度取菌液100 μL 涂于MRS 固体培养基上，37 ℃培养48 h。培养结束后，选择生长有50～150 个单菌落的平板，从中挑取典型菌落，继续在MRS 平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致。根据菌落的形态，革兰氏染色结果和过氧化氢酶活性对其进行初步的判定。最初鉴定为乳酸菌的菌株在含40%（体积分数）甘油的MRS 液体培养基中于-80 ℃冷冻保存。所有菌株在试验前都在MRS 平板上划线活化2～3 次。

1.3.2 高效降胆固醇乳酸菌的筛选 将1.3.1 节筛选的菌株在MRS 肉汤中培养18 h 后，通过离心（8 000 r/min，5 min，4 ℃）收获菌体细胞，并重悬于无菌生理盐水中使浓度达到约109CFU/mL。将菌悬液以2%（体积分数）的接种量接种到水溶性胆固醇含量为0.1 g/L 的MRS 肉汤（含0.3%的胆盐）中，37 ℃培养48 h。同时，以不接菌的培养基作为空白对照，以菌株ATCC 43121 作为阳性对照。

取发酵液于8 000 r/min 离心5 min，用无菌注射器取1 mL 发酵上清液，并通过0.22 μm 过滤器过滤到气相色谱样品瓶（2 mL）中。使用Agilent 7890A 气相色谱系统进行分析[12]。色谱条件：色谱柱（HP-5 弹性石英毛细管柱：30 m×0.32 mm×0.25 μm）；升温程序为100 ℃升至340 ℃（以20 ℃/min升温12 min）；进样口温度为250 ℃，检测口温度为300 ℃；载气（He）流速1.5 mL/min；进样量为0.5 μL；分流比5∶1。菌株的降胆固醇能力按式（1）进行计算。

菌株的降胆固醇能力（%）=（S0－S1）/S0×100

式中，S0——空白对照样品中胆固醇对应色谱峰的面积；S1——测试样品中胆固醇对应色谱峰的面积。

1.3.3 菌株的鉴定 将1.3.2 节中得到的高效降胆固醇的菌株在MRS 平板上进行划线培养，记录平板上的菌落大小、颜色、形态。用革兰氏染色法观察菌体形态，并通过JEM-1230 透射电子显微镜对菌体进一步观察。

采用细菌基因组DNA 抽提试剂盒，根据说明书提取目标菌株基因组DNA。将提取的乳酸菌基因组DNA 作为PCR 扩增的模板，采用细菌通用引 物 （27f：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT）进 行16S rDNA 的PCR 试验，对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。将PCR 产物送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.3.4 酸耐受性测定 将待测菌株悬浮于pH 值分别为1.5 和3.0 的MRS 肉汤中，将活细胞数校正至约108CFU/mL，在37 ℃下培养。在0，1.5，3和6 h 时采样，用平板计数法对培养液进行活菌计数。菌株ATCC 43121 作为对照菌株。以时间为横坐标，活菌数的对数lg（CFU/mL）为纵坐标，进行耐酸曲线的绘制。

1.3.5 胆盐耐受性测定 将待测菌体悬浮于胆盐含量分别为0.3%，0.5%和1.0%的MRS 肉汤中，将活细胞数校正至约108CFU/mL，在37 ℃下培养6 h。在试验的0 h 和6 h 取样，用平板计数法对培养液进行活菌计数。菌株ATCC 43121 作为对照菌株。菌株的胆盐耐受能力用式（2）表示：

式中N1——菌株在6 h 时的活菌数，CFU/mL；N2——菌株在0 h 时的活菌数，CFU/mL。

1.3.6 抗生素敏感性研究 根据临床和试验室标准研究所技术指南（CLSI）[13]，使用纸片扩散法[14]对菌株的抗生素敏感性进行研究。取100 μL 待测菌株的菌悬液（约107CFU/mL）均匀涂布于MRS 平板上。将含有抗生素的试纸用无菌的镊子平铺于琼脂培养基表面，然后将平板在37 ℃下培养24 h。使用游标卡尺测量抑制区的直径。用抑菌圈的直径评估菌株的抗生素敏感性。

1.3.7 植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 代谢产物的抑菌性能 采用国际通用牛津杯法测量植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 代谢产物的抑菌活性。将4 株指示菌的菌悬液（约108CFU/mL）按1%的量加入到LB 琼脂培养基（45 ℃）中，充分混合，定量加入15 mL/皿。待LB 培养基冷凝后，轻轻拔掉事先放置的无菌牛津杯 （直径为8.00 mm±0.01 mm）。定量以200 μL/孔加入菌株ZY08和I631 的发酵上清液样品，并以未接菌的MRS培养基（pH 6.2）作为空白对照。将接好发酵液的平板置于37 ℃，培养24 h。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 高效降胆固醇菌株的筛选结果

从婴儿粪便、泡菜和金华火腿共计32 个样品中分离得到102 株乳酸菌，这些菌株中有8 株菌的降胆固醇能力大于40.0%，如图1所示。菌株ZY08 和I631 去除培养基中胆固醇的能力高达67.45%和63.19%，显著高于ATCC 43121（P＜0.05）。菌株HT5 的降胆固醇能力为57.64%，与ATCC 43121 相比无显著差异（P＞0.05）。其余5 株菌的降胆固醇能力为40.31%～55.44%，显著低于ATCC 43121（P＜0.05）。因此，选取具有较强降胆固醇能力的菌株ZY08 和I631 用于后续研究。

图1 降胆固醇菌株筛选结果（a）及胆固醇的GC分离图谱（b）Fig.1 Results of cholesterol-lowering LAB strains screening （a）and GC pattern of cholesterol （b）

2.2 菌株的鉴定

菌株ZY08 和I631 的菌落形态、菌体形态及细胞形态如图2所示。菌株ZY08 菌落大小0.5～2 mm，呈圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑；菌体为单个、成对或短链状。菌株I631 菌落大小0.3～2 mm，呈圆形，乳白色，表面光滑湿润。采用透射电镜对上述2 株乳酸菌的细胞形态进行观察，不产芽孢，圆端直杆菌，大小为（0.2～0.4）×（2～5）μm。将菌株的测序结果在NCBI 网站上进行BLAST 序列比对，结果显示菌株ZY08 与植物乳杆菌同源性达到99%以上，菌株I631 与发酵乳杆菌同源性达到99%以上。因此，经16S rDNA 鉴定菌株ZY08 为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株I631 为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 酸耐受性结果

图3呈现了在pH 为1.5 和3.0 的酸性环境中植物乳杆菌ZY08、发酵乳杆菌I631 和ATCC 43121 在1.5，3 及6 h 时的存活情况。从整体来看，菌株I631 和ZY08 的酸耐受性显著高于ATCC 43121（P＜0.05）。pH 为1.5 时，3 株菌活菌数在0～6 h 都呈下降趋势。在3 h 时，菌株ZY08和I631 减少的活菌数小于1 个数量级；在6 h 时，菌株ZY08 和I631 的活菌数均大于6 lg（CFU/mL）。pH 为3.0 时，菌株ZY08 和I631 初始活菌数与6 h 时活菌数相比，分别减少了0.66 lg（CFU/mL）和0.32 lg（CFU/mL），2 株菌的活菌数均大于7 lg（CFU/mL）。Liong 等[15]报道了7 株干酪乳杆菌在pH 2.0 中培养2 h，活菌数由初始的10 lg（CFU/mL）减少为4.0～5.0 lg（CFU/mL）。前人研究发现一株具有降胆固醇能力的植物乳杆菌Lp45[16]在pH 3.0 条件下处理3 h，活菌数降低了约4.0 lg（CFU/mL）。与这些菌株相比，菌株ZY08 和I631在模拟胃酸环境下有较强的耐受性。

2.4 胆盐耐受性结果

图4为植物乳杆菌ZY08、发酵乳杆菌I631和ATCC 43121 对3，5 及10 g/L 胆盐的耐受性。与菌株ATCC 43121 相比，菌株ZY08 的胆盐耐受能力与其无显著差异（P＞0.05），菌株I631 的胆盐耐受能力显著低于菌株ATCC 43121（P＜0.05）。在胆盐为3 g/L 时，3 株菌的胆盐耐受能力均达到80%以上，其中菌株ZY08 的胆盐耐受能力高达88.32%。随着胆盐含量的增加，菌株的耐受能力也有不同程度的下降。但是，菌株ZY08 和I631 在10 g/L 高胆盐含量下仍具有较高的活性，胆盐耐受能力分别为47.56%和42.33%。这与Wang 等[17]的报道类似：1 株瑞士乳杆菌MG9-2 对0.3%的胆盐耐受力为87.89%，在10 g/L 的胆盐环境下耐受能力高达52.71%。因此，菌株ZY08 和I631 能耐受胆盐，满足了在肠道存活的基本要求。

图2 菌株ZY08 和I631 的菌落及菌体形态Fig.2 Colony and cell morphology of strains ZY08 and I631

图3 植物乳杆菌ZY08、发酵乳杆菌I631和ATCC 43121 的酸耐受性结果Fig.3 Acid tolerance of L.plantarum ZY08，L.fermentum I631 and ATCC 43121

图4 植物乳杆菌ZY08、发酵乳杆菌I631 和ATCC 43121 的胆盐受性结果Fig.4 Bile salt tolerance of L.plantarum ZY08，L.fermentum I631 and ATCC 43121

2.5 抗生素敏感性

根据CLSI 的药敏试验标准，对菌株的抗生素敏感性进行判断。菌株对抗生素越敏感，在药敏纸片周围的活性越弱，形成的透明圈即抑菌圈（如图5所示）越大。表1为植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 对8 种抗生素的敏感性结果。从表中可以看出，菌株ZY08 比菌株I631 对试验中的抗生素更敏感。菌株I631 对庆大霉素的敏感性呈中介，对其余的抗生素都呈敏感状态。菌株ZY08 对头孢唑林最敏感，抑菌圈高达（37.32±0.13）mm。菌株I631 对青霉素的抑菌圈 （32.12 mm±0.17 mm）最大。2 株菌对庆大霉素敏感性较弱。因此，菌株ZY08 和I631 都不具备耐药性，对人体健康不存在潜在威胁。

表1 植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 的抗生素敏感性Table 1 Antibiotic susceptibility of L.plantarum ZY08 and L.fermentum I631

图5 植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 抗生素敏感性示例图Fig.5 Antibiotic susceptibility of L.plantarum ZY08 and L.fermentum I631

2.6 抗菌活性

植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 的发酵上清液对4 种肠道致病菌的抑制作用如表2所示。菌株发酵上清液中代谢产物的抑菌作用越强，则牛津杯周围致病菌株的生长能力越弱，形成的生长抑制圈即抑菌圈（如图6所示）越大。整体来看，菌株ZY08 和I631 对4 种致病菌均有一定的抑制作用，尤其对G+菌金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的抑制作用最强（P＜0.05）。此外，菌株I631 对每个致病菌的抗性均高于菌株ZY08。菌株I631 对这4 种致病菌的抑制作用由大到小为：单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、鼠伤寒沙门氏菌。菌株ZY08 的抗菌活性由强到弱为：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、鼠伤寒沙门氏菌。因此，植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 生长过程中产生的代谢物质具有一定的抗菌活性，对人体肠道健康具有促进作用。

图6 植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 抑菌活性示例图Fig.6 Antibacterial activity of L.plantarum ZY08 and L.fermentum I631

表2 植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of L.plantarum ZY08 and L.fermentum I631

3 讨论

迄今为止，筛选益生菌的样品大多为泡菜、发酵乳制品、发酵肉制品、婴儿的粪便样品等，其中金华火腿、发酵酸鱼、乳扇、藏灵菇都是我国传统发酵食品，受全世界消费者的欢迎。传统发酵食品在我国具有悠久的历史，而且资源丰富、种类繁多，其中有一些优良的微生物是经过几千年的驯化才相传至今，这些微生物资源对于我们开发功能性益生菌来说具有重要意义。Zeng 等[18]从酸菜汁中分离出了1 株布氏乳杆菌P2，在体外能够清除43.95%的胆固醇。Jampaphaeng 等[19]从发酵的豇豆中分离出的植物乳杆菌KJ03 具有53.0%的胆固醇降低率。Ren 等[20]从婴儿粪便中分离出1 株降胆固醇能力为38.0%的嗜酸乳杆菌1.1854。1 株乳酸乳球菌BO37 的降胆固醇能力为43.7%[21]。与这些结果相比，本研究中来自婴儿粪便的植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 表现出优异的降胆固醇能力。但是，这2 株菌的降胆固醇机理还需进一步研究。

人体每天分泌约2.5 L 的胃液，空腹pH 为1.5，进食后pH 为3.0～5.0，同时肝脏每天分泌约1 L 胆汁到小肠中，胆盐含量为3～5 g/L[22]。因此，研究菌株在模拟肠胃环境中的存活情况，是益生菌开发过程中的关键工作。不同来源的乳酸菌对肠胃环境的耐受性是不同的，一般来源于人体自身的菌株具有更好的耐受性。本研究结果表明，植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 具有在低pH 和高胆盐环境下存活的潜力。这与植物乳杆菌LH-511、植物乳杆菌10-4、干酪乳杆菌11-6 的酸及胆盐耐受能力相似[23]。

目前，抗生素耐药性是全球公共卫生问题，人们也越来越关心益生菌的耐药性。也有研究[24]表明食物是乳酸菌转移抗生素抗性的潜在渠道。因此，在筛选益生菌时，评价其对临床相关抗生素的耐药性至关重要。在挪威乳制品中用作发酵剂的乳杆菌[25]具有对环丙沙星和庆大霉素的耐药性。1株被认为是潜在益生菌的乳杆菌ZDY2013[26]对青霉素具有中等耐药性。在这些研究中，菌株对抗生素的耐药性被认为是固有的，不会传递给其它肠道微生物。然而，Zielińska 等[27]报道了2 株植物乳杆菌对四环素具有耐药性，由于四环素耐药性在乳酸菌中是可转移的，因此这2 株植物乳杆菌并不能用于食品和人体中。本研究的植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 无耐药性，因此具有作为益生菌的潜力。

病原菌的抑菌作用是评价功能性益生菌的重要特性之一。本研究发现植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 对金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌有很强的抑制作用。前人研究报道了植物乳杆菌Lp9[28]能抑制单核细胞增生李斯特菌的生长，Abushelaibi 等[29]发现9 株乳酸菌对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。这些报道与我们的研究结果相似。其它研究[30-31]也报道了乳杆菌可以抑制大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。乳酸菌的抗菌活性与其代谢产生的有机酸（例如乳酸、乙酸）、过氧化氢、细菌素和胞外多糖（EPS）有关。

4 结论

本研究筛选得到了2 株具有较强降胆固醇活性的乳酸菌，植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631，体外降胆固醇能力高达67.45%和63.19%。同时，在pH 为1.5 和3.0 的条件下培养6 h，2 株菌的活菌数均大于6 lg（CFU/mL）；对3，5 及10 g/L 胆盐具有一定的耐受性，胆盐耐受能力均达到80%以上（胆盐含量为3 g/L）；对常见的8 种抗生素（青霉素、氨苄青霉素、头孢唑林、丁胺卡那、庆大霉素、红霉素、复方新诺明、氯霉素）都不具备耐药性，对人体健康不存在潜在威胁；2 株菌的代谢产物对4 种肠道致病菌（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、鼠伤寒沙门氏菌）具有一定的抑制作用。本研究所筛选的植物乳杆菌ZY08 和发酵乳杆菌I631 具有较好的益生潜力，可进一步用于功能性乳制品的开发。