茶多酚对人脂肪来源间充质干细胞成骨分化的影响

王 华，齐玉成，杨云芳，赵艺洋，王 慧，陈 培，杨旭芳

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.南方医科大学第一临床医学院，广东 广州 510515)

随着人口老龄化，骨质疏松症已成为影响人们生活质量的主要因素之一[1]。目前临床普遍采用经典的抗骨吸收和促骨形成药物，但对于因机体衰老导致的骨质疏松，疗效欠佳，此外上述药物还存在成本高昂等问题。基于上述原因，寻找一种高效、经济的药物已迫在眉睫。同时，临床上组织工程骨较自体骨移植治疗骨缺损修复方面具有明显优势，但如何获得丰富的种子细胞一直是构建组织工程骨所要解决的重要问题。有研究报道绿茶提取物茶多酚(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对骨髓间充质干细胞的成骨分化有影响，但结论不一[2]，关于EGCG对hADSCs成骨分化影响的研究仅见一篇[3]。故本研究以获取容易且具有高度增殖能力的hADSCs为研究对象，探讨EGCG对hADSCs成骨分化的影响。以期为骨质疏松症的治疗开发新的药物，并未为组织工程骨的研究提供丰富安全的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 材料脂肪组织来源于附属红旗医院外科。低糖DMEM(Hyclone,USA)，10%胎牛血清(Hyclone,USA)，0.25%胰酶(Invitrogen)，胶原酶Ⅰ(Invitrogen)，抗CD44、CD73及CD105单克隆抗体(BioLegend,USA)，BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂(碧云天，上海)，EGCG(Sigma,USA)，青霉素、链霉素(Sigma,USA)。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分离与培养 外科获得的脂肪组织，用灭菌PBS液反复冲洗，仔细分离去除血管及结缔组织，最后剪成1 mm3大小的碎块。用0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃消化60 min，200目筛网过滤，获得的细胞用条件培养基[4](LG-DMEM、10%FBS、100 μg/mL streptomycin、100 units/mL penicillin)重悬，37 ℃、5% CO2的孵箱内培养，2 d后首次换液，以后每3 d更换一次培养基，待细胞融合至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜观察不同代次hADSCs的形态特点，后续实验均采用P3代hADSCs。

1.2.2 流式细胞仪检测hADSCs表面标志 0.25%胰酶消化收集P3、P6及P9代细胞，每例样本细胞数为2×105个左右；细胞重悬于1mL 0.01 M PBS中洗涤2次，1500 r/min，10 min；弃去PBS，与一抗孵育液(一抗稀释度为1∶100)常温下孵育30 min；0.01 M PBS洗涤2次后，分别与FITC标记的二抗(稀释度为1：50)4 ℃避光孵育30 min；0.01 M PBS洗涤2次后，弃去PBS，再加入300 μL 0.01 M PBS重悬细胞，用于流式细胞仪分析。

1.2.3 hADSCs成骨分化 消化收集细胞，调整细胞密度为1×105/mL,接种于24孔板，实验分三组，即未诱导组、常规成骨诱导组及EGCG+常规成骨诱导组(简称EGCG组)，24 h后常规成骨诱导组换为成骨诱导基础培养液(含200 μmol/L维生素C、7 mmol/L β-甘油磷酸钠和0.1 mmol/L地塞米松的DMEM细胞培养液)，EGCG组更换为含5 μmol/L EGCG、200 μmol/L维生素C、7 mmol/Lβ-甘油磷酸钠和0.1 mmol/L地塞米松的DMEM细胞培养液，每3 d更换培养液1次，分别于诱导2周后，倒置相差显微镜下观察细胞形态学并照相，然后用0.1 mol/L PBS洗涤，4%多聚甲醛固定20 min，进行碱性磷酸酶(ALP)染色(细胞爬片，10%甲醛固定，碱性磷酸酶孵育液37 ℃孵育3 h，硝酸钴作用5 min，硫化铵处理1 民，常规脱水透明，封片)，以鉴定成骨细胞。

1.3 统计学分析采用SPSS 25.0，计数资料以百分率(%)表示，采用卡方检验。

2 结果

2.1 诱导前后hADSCs的形态学特点倒置显微镜下可见：未诱导hADSCs形态均一，长梭形，呈现成纤维细胞样，当细胞融合至80%左右时，表现为鱼群样或漩涡样生长。成骨诱导2周后，部分细胞由长梭形变成多角形，细胞呈现聚集趋势(见图1)。

图1 诱导前后hADSCs的形态学特点(×100)

2.2 hADSCs表面标志利用流式细胞术分别检测P3、P6及P9代hADSCs的免疫学标志，结果显示各代hADSCs CD44、CD73及CD105阳性率高达93%以上，不同代次间表达无统计学差异(见图2)。

2.3 hADSCs成骨分化未诱导组hADSCs ALP染色胞浆呈现为淡灰色，ALP活性为阴性；hADSCs常规成骨诱导组于诱导2周后ALP染色，细胞胞浆呈现灰黑色，ALP活性为阳性；EGCG组ALP染色，可见胞浆为深黑色，ALP活性呈强阳性(见图3)。

图2 流式细胞术动态检测hADSCs表面标志

图3 hADSCs成骨分化后ALP染色(×100)

3 讨论

hADSCs是近年来生物医学研究中颇具吸引力的多潜能细胞。主要位于脂肪组织的基质血管部分(SVF)中[5]。hADSCs比其它间充质干细胞(MSCs)具有更显著的优势，首先因为它易于提取，在局部麻醉下就可进行，同时对患者造成的损伤更小。其次，很容易从已收获的组织中分离出目标干细胞[6-7]。更重要的是脂肪来源的干细胞具有高度的增殖能力，并且数量要远高于骨髓来源的干细胞[8]，体外培养的不同代次hADSCs能够稳定表达间充质干细胞的表面标志。

EGCG是绿茶中最具生物活性的儿茶素之一，已被证实其在体内外均可促进骨形成[9]。多项临床研究表明，饮茶对骨骼有积极的影响。饮茶者有更好的骨密度和更低的髋部骨折率[10]。Nash等学者的研究表明经常喝茶的人椎骨密度比不喝茶的人高[11]。一项与骨质疏松性骨折相关的5年前瞻性试验的横向分析也表明，与非饮茶者相比，饮茶者的骨密度损失率较低[12]。

然而，研究者对于EGCG在促干细胞增殖及成骨分化中的影响存有一些争议。有研究[13]提出，1μmol/L的EGCG就能抑制小鼠间充质干细胞D1细胞系增殖。这种差异可能是实验使用的细胞来源不同导致。Kamon等[14]提出EGCG通过剂量依赖性的方式，抑制了小鼠成骨细胞前体细胞(MC3T3--E1)的成骨分化；而Sakai等[15]则认为EGCG明显增强了前列腺素-2α介导的骨保护素合成，从而促进了干细胞的成骨分化。但MC3T3-E1的分化潜能较弱，因此并不能以此否定了EGCG对干细胞成骨分化的正向作用。

禁食条件下，饮用一杯绿茶可使EGCG在血液循环中的浓度达到1 μmol/L[16]，口服1.6 gEGCG可使其在人血浆中达到7.6 μmol/L的浓度。本实验中，EGCG促进hBMSCs成骨分化的有效浓度为5 μmol/L，因此在日常饮茶中很容易达到有效浓度。

本实验结果表明EGCG在5 μmol/L时能增强hADSCs的成骨分化，因此EGCG在hADSCs骨组织工程中具有潜在的应用价值。但EGCG在促hADSCs成骨分化方面的具体机制我们尚不了解，后续实验我们将进一步探讨其促成骨分化的分子机制。