高危型人乳头瘤病毒联合宫颈液基薄层细胞学检测在宫颈上皮内瘤变筛查中的应用价值

李婷婷，王翠峰

宫颈癌是世界范围内危害女性身心健康的第二大常见恶性肿瘤，目前其发病率在妇女恶性肿瘤发病总数中居第4位，且近年来发病年龄渐呈年轻化趋势［1］。在我国，近年来宫颈癌的病死率虽有所下降，但各级医院对于宫颈癌患者的收治比例却呈上升趋势［2］。研究表明，宫颈癌可防可治，由宫颈癌前病变发展为宫颈癌要经历较长潜伏期，宫颈癌的主要发病原因是高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续性感染［3］，故进行宫颈癌的早期筛查并阻断其恶化对该病的防治意义重大。我国普遍应用的宫颈上皮内瘤变筛查方法包括HPV检测、宫颈液基薄层细胞检测（TCT）、电子阴道镜检查等，这些方法极大地提高了宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的检出率。但单独采用以上筛查方法进行检测各有弊端，如HPV检测无法排除一过性感染的影响，TCT有操作误差,阴道镜检查具有创伤性等，无法保证筛检的准确率。为了更加有效地对宫颈上皮内瘤变进行筛查，且能够针对基层医院开展，本研究主要采用第三代杂交捕获定量分型（DH3）技术检测宫颈HPV感染情况并行TCT，以探讨两种检测方法联合对宫颈上皮内瘤变的筛查价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 经包头医学院第一附属医院医学伦理委员会审批后，选择2020年1—6月于包头医学院第一附属医院进行宫颈筛查的女性患者1 620例作为研究对象，年龄20～78岁，平均年龄37岁。纳入标准：（1）检查前3 d无阴道用药、无性生活、无外阴清洗；（2）月经结束后3～7 d；（3）有性生活史；（4）未进行宫颈锥切术或子宫切除术。排除标准：（1）已经确诊为宫颈癌前病变或宫颈癌的手术治疗后复查者；（2）妊娠期妇女。

1.2 样本的收集与存储 采用杭州德同生物技术有限公司和湖北德立森科技有限公司提供的HPV和TCT所需一次性取样器，围绕子宫颈顺时针方向转动数周并刷取宫颈外口与宫颈管内的脱落细胞，将刷取到的脱落细胞分别放入HPV取样管及TCT保存液瓶中保存。

1.3 HPV检测 采用杭州德同生物技术有限公司提供的HPV核酸检测试剂盒，在HPV取样管中加入变性试剂，65 ℃水浴45 min后室温保存，将样本吸取至已经加入探针试剂的杂交板孔内，65 ℃孵育60 min。降至室温后将上述样本转移至对应捕获板中振荡60 min，然后移除捕获板中液体并拍干，加入检测试剂25 ℃孵育45 min。接着移除液体、使用清洗液洗板并拍干，加入底物试剂，室温避光15 min后于化学发光免疫分析仪上读数。通过杂交捕获-化学发光方法对14种HPV型别进行检测〔2种极度高危型（HPV16、HPV18）、12种高危型（HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68）〕，检测到其中1种HPV型及以上者为阳性，未检测到者为阴性。

1.4 TCT 取TCT保存液瓶，将刷取到的宫颈脱落细胞以离心半径8 cm、1 200 r/min的速率离心5 min，弃上清液后，经湖北德立森科技有限公司提供的制片染色一体机进行处理，得到直径为2 cm的薄层细胞涂片，封片、镜检。依据伯塞斯达系统（TBS）宫颈细胞学分类法对结果进行判读［4］。宫颈鳞状上皮内病变分级标准：（1）未见上皮内病变或恶性病变（NILM）；（2）无明确意义的非典型性鳞状细胞（ASC-US）；（3）低级别鳞状上皮内病变（LSIL）；（4）非典型性鳞状细胞，不除外高级别鳞状上皮内病变（ASC-H）；（5）高级别鳞状上皮内病变（HSIL）；（6）鳞状上皮癌（SCC）。以NILM者为阴性，除NILM外其余病变者均为阳性。

1.5 病理学检查 医师借助电子阴道镜使用活检钳对于无异常者行常规3、6、9、12点4处取材检查，对于异常者则行异常区域多点取材检查。样本放在10%的甲醛溶液中固定，送本院病理科进行检查。按照病理学的诊断标准［5-6］将宫颈病变分为：（1）正常或炎症；（2）宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ）；（3）宫颈上皮内瘤变Ⅱ级（CINⅡ）；（4）宫颈上皮内瘤变Ⅲ级（CIN Ⅲ）；（5）宫颈癌（鳞癌、腺癌）。以正常或炎症者为阴性，其余诊断均为阳性。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析，绘制四格表以分析HPV检测、TCT及二者联合筛查宫颈上皮内瘤变的价值。

2 结果

2.1 检测结果分析 在1 620例患者中，病理学检查阳性者187例，阴性者1 433例；HPV检测阳性者619例，阴性者1 001例；TCT阳性者449例，阴性者1 171例；HPV检测联合TCT阳性者205例，阴性者1 415例（见表1）。

表1 HPV、TCT及二者联合检测结果分析Table 1 Results of HPV test，TCT and the combination of the two for screening cervical intraepithelial neoplasia in 1 620 cases

2.2 HPV检测与病理学检查阳性结果的对照分析 187例病理学检查为阳性的患者中，HPV阳性152例，阴性35例（见表2）。

2.3 TCT与病理学检查阳性结果的对照分析 187例病理学检查为阳性的患者中，TCT阳性141例，阴性46例（见表3）。

2.4 HPV检测联合TCT与病理学检查阳性结果的对照分析 187例病理学检查为阳性的患者中，HPV检测联合TCT阳性181例，阴性6例（见表4）。

表2 HPV检测与病理学检查阳性结果的对照分析Table 2 Comparative analysis of HPV test and cervical histopathological positive results

表3 TCT与病理学检查阳性结果的对照分析Table 3 Comparative analysis of TCT and cervical histopathological positive results

表4 HPV检测联合TCT与病理学检查阳性结果的对照分析Table 4 Comparative analysis of HPV test combined with TCT and cervical histopathological positive results

2.5 筛查价值 HPV与TCT联合检测对宫颈上皮内瘤变筛查的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均高于HPV和TCT单项检测（见表5）。

3 讨论

宫颈癌的发病是一个复杂的过程，除了已知的高危型HPV感染外，还涉及多种癌基因与抑癌基因的表达及调控，也涉及生物学、个人行为、遗传易感性等诸多因素的影响［7］。由于近年来传统观念改变、性生活过早发生、忽略自我行为卫生等原因，宫颈癌发病呈现低龄化，发病率逐年升高［8］。宫颈癌早期病变的症状并不十分明显，难以引起患者足够的重视，特别是在较偏远地区的女性，缺乏宫颈疾病知识的普及、易忽视自身健康，宫颈轻微病变最终发展为宫颈癌的可能性更大［9］。研究表明，宫颈病变被诊断为上皮内瘤变后若不采取正确手段治疗则病变分级会逐渐增加直至转化为宫颈癌［10］，故早期诊断并及时治疗对降低宫颈癌的发病率和死亡率有很大临床价值。目前宫颈癌诊断的金标准是病理学检查，但存在创伤较大、操作复杂的弊端，无法应用于人群筛查［11］。此外，宫颈癌前病变一旦发展为宫颈癌，后期治疗过程中存在个体差异、术后转移复发等问题，无疑会加重患者生理和心理上的负担，影响其生存质量。因此通过宫颈癌筛查尽早发现宫颈组织的异常表现并进行干预是预防宫颈癌发生并延长患者生存时间的重要措施。

表5 HPV、TCT及二者联合检测对宫颈上皮内瘤变的筛查价值Table 5 The value of HPV test，TCT and their combination in screening cervical intraepithelial neoplasia

目前临床主要通过HPV和TCT对宫颈上皮内瘤变进行筛查。HPV是一种嗜上皮型环状DNA病毒，侵入机体后在适宜条件下与机体的基因组整合并呈高表达，可促进宫颈癌的发生［12］。有研究显示绝大多数的宫颈癌患者早期曾有过HPV感染，宫颈疾病与不同HPV亚型或亚型的多重感染有密切联系［13］。HPV的检测可以有效判断是否存在HPV感染以及感染的病毒型别，是宫颈上皮内瘤变初筛的重要手段。但HPV常存在一过性感染的情况，一定时间内免疫系统可以对其进行自我清除，且不同型别HPV的感染具有不同的临床意义。TCT主要通过细胞形态学对宫颈病变进行判断，对已发生病变且形态改变的宫颈上皮细胞诊断效果较好，但对宫颈上皮内瘤变的诊断效果不佳［14］。TCT操作简单，在应用液基薄层制片技术后已降低了多项因制片操作不当而造成的误差，提高了准确率，但因该技术对检验者的知识储备与经验有较高要求，故单独使用该技术的效果与临床的预期仍有一定差距［15］。本研究使用了DH3技术对高危型HPV的14种型别进行检测，其原理为：HPV的DNA双链裂解变性为单链，单链DNA与特异性RNA探针结合为杂合体，DNA-RNA杂合体与捕获板上的特异性抗体结合后固定于该捕获板，再与耦联碱性磷酸酶的抗杂合体的特异性抗体结合，最后通过酶促化学发光法检测样本中的HPV含量。

在HPV的检测中，第二代杂交捕获技术（HC2）是临床公认的检测方法，灵敏度高、重复性强。但HC2只能进行定量检测而无法对高危型HPV进行分型，且价格昂贵，不适宜在我国普及。DH3技术在2014年8月获得我国国家食品药品监督管理总局认证，既能对HPV进行定量检测，又能对HPV16、18型进行风险分层，且操作快速、简便。DH3技术对感染HPV的患者检出率及与HC2检测结果的符合率均较高，并且相对价格低廉，能够有效减轻患者负担、节约医疗资源［16-18］。有研究表明，DH3技术对HPV16和HPV18阳性患者的宫颈疾病检出率要高于HC2［19］。本研究以病理学检查为金标准，HPV16型和18型检出率高于其他12种型别，符合高危型HPV感染相关研究结果［20］，但是单项检测的筛查价值却明显低于HPV检测联合TCT，分析可能原因为机体通过免疫机制对HPV的轻微感染进行了清除，后期再无HPV的深入感染［13］。TCT单项检测能观察细胞形态，对照病理阳性结果，宫颈上皮内瘤变级别较低的患者易被误诊，这可能与病变早期细胞形态变化不明显有关。此外，TCT判读结果与病理学检查不符的原因还可能是滴虫、细菌、真菌感染等影响宫颈细胞形态［21］，以及TCT制片和取材过程中存在一定的污染，这对相关人员的操作技术提出了更高的要求。当进行两项检测的联合应用时，明显使检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值得以提高，与病理学检查有较高一致性。HPV检测可以提醒患者有无病毒感染，却无法判断宫颈组织是否发生病变；TCT能够有效判读已出现细胞学改变的宫颈上皮内病变，但受检验人员主观判断和其他干扰因素的影响较大。两项检测单独应用时各有优缺点，而联合应用则可取长补短，提高宫颈上皮内瘤变的筛查效率，为临床提供更多的诊疗支持信息。本研究结果也提醒患者两项检测结果均为阳性时，应引起重视，立即行宫颈组织病理学检查以及早发现宫颈上皮内瘤变情况，进行早期治疗。

综上所述，HPV检测联合TCT在女性宫颈上皮内瘤变的筛查过程中具有单项检测不具备的优点，灵敏度和特异度显著升高，可有效弥补单一检测方法的不足并使所得检测结果更加可靠，反馈临床后对宫颈上皮内瘤变的诊断和治疗有积极的作用，适宜于临床的推广应用。但由于本研究样本有限，且宫颈上皮内瘤变也存在一定地区分布差异，故今后需要进行更多相应的临床研究。

作者贡献：李婷婷进行文章的构思与设计，研究的可行性分析，文献/资料收集、整理，撰写论文；李婷婷、王翠峰进行论文的修订、英文的修订；王翠峰负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。