甲氨蝶呤PLGA微球制备工艺及体外释药性能考察

任泽宇，姜宏，许燕，石永芳

(1 新疆大学机械工程学院，新疆 乌鲁木齐 830047；2 新疆医科大学医学工程技术学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，约占原发性恶性骨肿瘤42%，每年发病率约为2～3/100万/年，多发于儿童和青少年之间，具有生长迅速与早期转移等特点[1-2]。目前主要是以术前化疗—手术摘除瘤段—术后化疗的治疗模式[3]。骨肉瘤辅助化疗药物有阿霉素、异环磷酰胺和甲氨蝶呤(MTX)，其中MTX在遏制骨肉瘤的生长疗效最佳[4]，是近30年作为骨肉瘤化疗的常用药。但术后服用甲氨蝶呤等药物，由于MTX具有毒性，会导致骨组织自身硬度大且病灶区域药物浓度较低，若提高患者服用剂量，毒副作用大，患者体内易产生耐药性[5]。现有研究将MTX与生物可降解高分子材料复合制备抗骨肉瘤药物的骨组织工程支架，使药物可直接作用于病灶肉瘤组织，杀死残留肿瘤细胞，大大降低口服MTX的毒副作用[6-7]。但药物与可降解高分子材料的直接复合，易突释，造成短时内局部药物浓度过高，释药不稳定。为实现药物在病灶区域的稳定和长期持续释放，本研究以甲氨蝶呤为药物，聚乳酸-羟基乙酸共聚物为药物载体，制备载药率、包封率以及缓释性能均良好的载药微球，为解决骨肉瘤问题提供新的治疗方式。

目前，制备载药微球多采用乳化剂挥发法，超声加工制备载药微球，但超声加工易出现弊端：一是若超声时间短，会使大量有机溶剂残留在微球体内，微球质量下降；二是若超声时间长，微球受力不均，会使微球表面凹陷甚至破损，使得微球的载药率、包封率下降，无法满足治疗目的。因此，研究制备安全，高效，可重复操作的微球加工工艺过程是实现一体化的最终需求。本实验采用乳化剂挥发法，通过正交实验优化加工工艺参数，以微球的载药率，包封率及其体外的药物缓释为评价指标，优选微球制备的最佳工艺参数，并通过释药动力学方程探究生物可降解载药微球在体内的释放过程。

1 材料与方法

1.1 材料

甲氨蝶呤(中国源叶生物公司)；聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA，源叶生物公司，50：50，特性黏度0.26、0.46、1.6 dl/g);聚乙烯醇(PVA，纯度>99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；二氯甲烷(南京化学试剂一厂，分析纯)；蒸馏水(PH=6.5-7，河南新源科技有限公司)；磁力搅拌器(莱州元茂仪器有限公司)；超速离心机(日本日立SCP85H)；DZD电子天平(天津沐恒称重设备科技有限责任公司)；恒温水浴振荡箱(宁波科学仪器研究所)；UV1900PC 型双光束紫外可见光分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTX-PLGA载药微球的制备

微球采用O/W乳化剂挥发法制备[8]。称取50 mg PLGA溶于2 mL二氯甲烷中，待充分溶解后加入5 mg MTX。按设计要求分别匀速缓慢滴加浓度为1.5%、2%及2.5%的PVA溶液。恒定温度下，设定不同搅拌转速，搅拌4～8 h，去除二氯甲烷。所得产物离心分离，去上清液，离心管中沉淀用15 mL PBS摇匀洗涤3次，冷冻干燥24 h后，即可制得MTX-PLGA载药微球。

1.2.2 MTX-PLGA载药微球颗粒表征

取少量冻干微球分散在导电胶上，粘牢后对样块进行喷金处理，以增强导电性，使用电子扫描显微镜，观察在不同工艺参数下制备的载药微球微观形貌，随机对样品的不同区域进行采集图像。从扫描电镜图中随机选择区域，并随机挑选500颗形态完整的微球进行粒径分布计算。

1.2.3 设计正交实验

本次实验在前期实验基础上，经过分析，设计实验影响因素主要有制备微球的PVA浓度(mg·mL-1)、磁力搅拌器转速(r·min-1)、温度、二氯甲烷剂量、滴加速度，其中前三者影响程度较大。设计正交试验L9(34)考察多因素条件对载药微球的载药量及药物释放等影响，研究制备微球的最佳条件，绘制因素水平表1。

表1 正交因素水平表

1.2.4 MTX标准曲线的绘制

精确称取甲氨蝶呤 25 mg，置于50 mL容量瓶中，制备250 μg·mL-1的标准储备液，加入不同比例PBS配置5、10、15、20、25、30 μg·mL-1MTX标准溶液。UV- Vis分光光度计在306 nm处测定。MTX标准曲线为Y=23.522X+1.073 6，R2=0.998 2，如图1所示。

图1 甲氨蝶呤标准曲线

1.2.5 回收率测定

配置125、50、10 μg·mL-1的高、中、低3个浓度的甲氨蝶呤溶液(pH=7.4的PBS为溶剂)，分别在溶液中加入10 mg空白微球，摇匀，静置3 min后，离心取上清液，测定其在306 nm处的吸光度A代入标准曲线方程和回收率计算公式得回收率。

(1)

1.2.6 精密度考察

取浓度分别为125、50、10 μg·mL-1的高、中、低3个浓度的甲氨蝶呤溶液，按照1.2.5步骤测定回收率，1 d之内重复测定5次，计算平均值为日内平均回收率，计算标准差为日内精密度。并分别连续测定5天，计算日间平均回收率，计算标准差为日间精密度(表2)。

表2 微球含量测定方法精密度的考察结果 n=5

1.2.7 载药量和包封率的测定

精确称取25 mg微球，置于离心管中，加入5mL PBS缓冲液，离心3次，取上清液，后用超声机90 W超声30 min，24 h后再次超声，后放入37 ℃恒温水浴中振荡24 h，离心，取上清液，测定吸光度，根据公式计算：

(2)

(3)

1.2.8 微球的体外释放

精确称取25 mg微球作为实验组，称取同等质量MTX为对照组，置于透析袋中，加入2 mL PBS缓冲液，用透析夹夹紧。放入装有50 mL PBS缓冲瓶中，37 ℃下，恒温水浴振荡箱振荡，每隔一定时间取样5 mL，同时以5 mL PBS作为补充液，所得样品用紫外分光光度计测量Abs，计算药物浓度，通过公式计算释药百分率：

释药率=释放药物的质量/微球载有药物质量×100%

(4)

1.2.9 释药动力学方程拟合

载药微球进行释药动力学的研究，主要为了实现释药速率的可控性和可预测性，药物缓释可控技术的重要指标是微球缓释过程中，释放药物的速率和释放量。目前，多位国内外的学者通过搭建数学模型，模拟分析微球释药行为，以减少实验周期，为同类型载药微球的设计提供参考。

用乳化剂挥发法制备的微球，会因为有机溶剂的快速挥发导致微球表面和内部形成大量孔隙，这些孔隙为药物的释放和材料的降解提供了重要的传递通道。而正是由于释药后期引发孔隙的改变，形成复杂多变的释药机理。本次实验通过之前建立起的数学模型对该实验方法下制备的载药微球的缓释机理进行预测和验证。采集最优加工工艺参数下制备的微球缓释数据，利用表3中释药模型进行动力学方程拟合，推测微球释药机理[9]。

表3 释药动力学模型

2 结果

2.1 MTX-PLGA载药微球颗粒表征

通过SEM图2可知，转速300 r·min-1条件下制备的载药微球表面光滑，完整性较好。当转速达到800 r·min-1时，载药微球表面出现明显凹陷。结果表明，磁力搅拌器转速对微球表面形态有较大影响，其原因可能是在转速300 r·min-1以内时，PLGA的包裹性没有被破坏，使微球在粒径较小的情况下还能具有良好的机械强度，提高了微球的载药及包封能力，以及持续且稳定的释药过程。用 Nano Measure软件分析微球粒径分布，如表4所示。随机挑选500个制备的微球，在电镜下测量其粒径，其中粒径在15.6 μm以内的占总个数的90%，说明通过此方法可制备粒径较小的载药微球。

图2 工艺参数对载药微球的影响

表4 载药微球粒径分析

2.2 正交试验结果分析

通过对PVA浓度，转速，温度进行正交实验优化选择制备微球最佳工艺参数，以微球载药率和包封率为评价指标判断微球质量[10]。微球载药率越高，包封效果越好，说明制备微球的加工工艺过程越好。

在制备微球的加工工艺参数中，搅拌转速、配置水相PVA溶液的浓度、温度都会影响载药微球的载药率和包封率。磁力搅拌器转速的P<0.05，说明磁力搅拌器转速对结果影响显著，PVA浓度、温度影响不显著。因此磁力搅拌器转速为主要因素，PVA浓度、温度为次要因素。当PVA浓度和温度不变时，改变磁力搅拌器转速，载药率随着转速的提升而减小，成反比关系(表6)。PVA溶液的浓度和温度在一定范围内与微球的载药率成正比，但随温度的升高，载药率只会轻微升高。这可能是因为磁力搅拌器虽然可以提供稳定持续的剪切力，但转速改变粒径大小的同时，也会影响微球表面的形态，高转速会提供大的剪切力，虽然会使得制备的微球粒径变下，但由于破坏了PLGA与药物之间形成的化合建，使得做制备的微球表面粗糙，孔隙多且大，从而破坏了包载药物的能力，载药率和包封率随之下降。PVA作为乳化剂稳定剂也作为水相，PVA浓度不足，将导致微球粒径增大，PLGA难以形成较小的乳滴，也会影响微球成型的稳定性与完整性。根据文献和单因素实验结果，采用正交试验综合评分法，将载药率和包封率进行加权求和作为评价标准，根据极差R值的大小确定影响因素的主次顺序，极差值越大则对实验指标影响越大，从表5可以看出，影响MTX载药微球工艺参数的主次顺序为搅拌转速>PVA浓度>温度，最优的组合工艺为磁力搅拌器转速在300 r·min-1，PVA浓度2 mg·mL-1，温度30 ℃时，可制备载药率和包封率良好的微球。按照此方案重复制备3批微球，微球形态规整，微球的载药率为3.3%±0.16%，包封率59.64%±0.51%。

表5 甲氨蝶呤/PLGA微球制备方案正交试验结果

表6 方差分析结果

2.3 MTX-PLGA微球体外释放

微球的体外释放百分比如图3所示。释药第一阶段，实验一组8 h内释放的药物达到39.78%，突释现象明显，这可能是高转速下，具有较大的剪切力，破坏了微球载体与药物结合能力，致使微球前期释药过快,在前8 h内大量释放药物，局部药物浓度过高，不仅会破坏正常细胞的形态，严重还会引起炎症反应和免疫排斥反应。对照组中的MTX在前8 h累计释放药物达到30%，突释明显，而实验三组所制备的微球在前期释放缓慢，8 h内释放药物含量为11.17%，说明在此方法下微球包裹性好，微球表面所含药物含量少，药物与微球结合能力强，根据前8 h释放情况，没有明显突释现象。在该方法下，PVA浓度事宜，乳滴形成过程稳定，具有良好的包裹性。第二阶段体外释药期为12 h后，微球的药物释放速率明显减缓，但由于第一阶段造成的微球壁上的药物完全释放，在微球体内的药物由于PLGA中高分子量的阻碍，使得药物扩散减缓。假设微球不会发生溶蚀，且结构完好，微球中的药物释放将变得极其缓慢甚至不再发生药物释放，由于制备微球的材料是可降解的，体外的液体会渗透到微球内部，致使PLGA中的分子链发生水解和断裂。而MTX是疏水性药物，体外渗透的水分子也将阻碍MTX的释放[11]。所制备的微球在该阶段均释放缓慢。在最优参数条件下制备的微球出现裂缝少，药物与载体结合能力强，因此还能保持缓慢平稳的释放药物。释药最后阶段，伴随微球内部药物的溶解释放，微球产生溶蚀，在此期间药物扩散和微球溶蚀决定药物的释放速率[12]。由于前期释放孔隙的增大，药物扩散也更加迅速，但受限于药物浓度的影响，释放速率减缓。至120 h时，高转速下的第一组实验药物累计释放量达97.75%，MTX累计释药达76%，而低转速下的载药微球释放量仅为34.17%。综上，在转速为300 r·min-1条件下制备的微球，具有比MTX前期更平缓的释药速率，和更稳定持久的的释药性能。

图3 MTX-PLGA微球体外释放曲线

2.4 释药动力学模型拟合

对最优工艺参数所制备的载药微球进行体外药物缓释实验，通过表3中的数学模型进行拟合。在释药动力学方程拟合中，R2是决定因素，R2越趋近于1，则方程的拟合效果越好，说明越符合此释药机理[13]。为了更直观地考察载药微球的释药机理，将不做处理的MTX进行体外释药并设为对照组。通过表7可知，MTX体外释药曲线分别用零级、一级、Higuchi和Peppas数学模型进行拟合后，MTX的释放更符合Peppas方程，说明未经改性的MTX在体外释放过程主要通过药物本体均匀溶蚀释放。由表8可知，包载甲氨蝶呤的PLGA载药微球的释放过程采用Higuchi和Peppas拟合后得到的R2接近于1，说明扩散和溶蚀是主要释药方式。释药初期，微球以表面药物自由扩散为主。后期随药物不断释放，微球表面产生溶蚀凹陷，使得药物释放阻力减少，加快了微球的溶解。通过拟合方程可知，该制备工艺条件下的微球满足生物可降解微球的释药过程，微球在释药初期是微球表面药物向体外扩散，随着扩散难度的增大，微球开始发生溶蚀现象，使微球体内的药物可以稳定持续的释放，此释药机理与拟合结果一致。同时，结合体外释药曲线分析，工艺参数优化后的微球不仅更接近理想的释药效果，还有效地降低了MTX前期药物突释的风险，在相对较低的释药速率下，展现了较好的释药稳定性。

表7 MTX释药动力学方程

表8 载药微球释药动力学方程

3 讨论

在制备微球的初期，将配置好的PLGA，MTX与二氯甲烷结合后作为油相滴加至PVA水相稳定剂时，PLGA和二氯甲烷会在PVA溶液上形成大乳滴并迅速下沉，随后即被搅拌子破碎成小液滴，时间短促，但此过程直接关系到微球的粒径及其分布，需控制好滴加入PVA溶液的速度及时间。实验结果表明，滴加PLGA/二氯甲烷/甲氨蝶呤油相至PVA溶液中，此阶段是大乳滴将由于连续搅拌PVA溶液变成小乳滴。在最佳制备工艺下，延缓了溶蚀现象发生的时间，保证了在120 h内，MTX可以平缓稳定的释放，这是由于低转速下，可以形成合适的剪切力，PLGA作为油相，拥有较大的粘性，形成大的乳滴，而大的乳滴难以破碎成小乳滴。此时，增加该实验方法中PVA的浓度，微球形成过程中，粒径变小的速率明显变快，可能是PVA在该实验方案中充当乳化剂稳定剂作用，PVA浓度越大，乳滴固化越快，微球表面越稳定。

通过正交实验，最终确定微球的最佳制备工艺为磁力搅拌器转速300 r·min-1，PVA浓度2%，温度为30 ℃，经过优化后的微球具有较高的载药率和包封率，对比MTX体外释药，此方法制备的微球无明显突释现象，释药持续且稳定。通过释药拟合方程可知，优化后的微球释药符合Higuchi和Peppas方程，说明微球中药物释放是由扩散和溶蚀机理共同作用。因此本研究结果表明，利用磁力搅拌器可制备出能满足理想生物降解条件的载药微球，为解决骨肉瘤问题提供了一种新的治疗方式。