非洲猪瘟病毒检测方法研究进展

宫 婷

（辽宁省桓仁县农业农村局，辽宁 桓仁 117200）

非洲猪瘟简称ASF（African swine fever），是一种容易引起家猪或者野猪发生急性、热性的传染性疾病，其传播途径通过密切接触而来，其病原名称为非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV），被世界动物卫生组织（OIF）定性为必须报告的动物疫病，我国定性一类疫病[1]。在我国，首例被确诊的非洲猪瘟是在2018 年8月，从此之后，非洲猪瘟已经蔓延到了全国多个省市自治区和直辖市，给我国养猪行业及配套产业带来了非常严重的经济损失，甚至影响到了市场的肉类供应。

目前，国际上针对此病还没有研制出可以预防的有效疫苗，防控疫病的方法主要采取生物安全措施。针对ASF 做及时明确的病原学检测可以有效的为制定各项防控措施提出指导，对于疫病防控实施效果评估提供有利的依据。文章将主要的病原学检测方法进行了解析，为ASF 的防控工作以及研发高效可行的诊断技术提供了参考内容。

1 病毒分离

首先要从病猪身上采集血液、脾脏、淋巴结等组织样本，在其样本上接种诸如猪肺泡巨噬细胞这样的原代细胞，ASFV 在这些容易受到感染的细胞中产生病变同时产生复制。如果在培养的细胞组织中注入猪红细胞，那么绝大多数的ASFV 就会对红细胞产生吸附的反应，这种包围猪红细胞的状态有一个好听的名字叫“玫瑰花环”。由于还有一部分的非洲猪瘟病毒株对于红细胞不会产生吸附反应，如果在分离培养的组织中没有出现吸附反应而是产生了细胞裂变，那么就要通过免疫荧光或者是PCR 的方式来对细胞进行确认，看看是否有非洲猪瘟病毒的存在；检测中需要注意，免疫荧光和PCR 要传代3-5 次成阴性反应才可以被认可为阴性。如果是首次爆发ASF 的地区，在通过PCR 或者免疫荧光等方法监测的结果都是阳性的话，就需要再进行红细胞吸附反应的实验来验证[2]。

2 抗原检测

2.1 免疫荧光法

免疫荧光法是ASF 的检测方法之一，被世界动物卫生组织所推荐。这个方法是针对脏器涂片或者薄层冷冻切片等加入异硫氰酸荧光素来标记抗ASFV 特异性抗体，以此来实现检测。这种检测方法主要是针对不产生HAD 的ASFV 毒株感染进行鉴别工作，还可以用来对ASFV 产生CPE和其它病毒产生CPE 进行区别。免疫荧光检测法对于急性ASF 感染的检测时效极高，但是对于亚急性或者是慢性感染的检测就不那么迅速了，这与感染组织可能已经异变成抗原体复合物阻止了与检测用抗体相结合的通道有关[3]。

2.2 ELISA 法

ELISA 检测法是通过Wardley 等用抗ASFV的特异性血清IgG 作为包被蛋白而进行的检测法，其对于 ASFV 抗原检测浓度为 50-500 HAD50/ml。基于p72（病毒衣壳蛋白）单抗的双抗夹心ELISA 法具有较强的灵敏度[3]。目前，针对这种检测方法，已经发明了ASFV 抗原ELISA 检测试剂盒，其设备要求低，使用起来简单，性价比高，在市场上流通很快，但是与荧光定量PCR 检测法相比，检测的准确性和特异性还需要进一步的提升。

2.3 免疫层析试纸条法

免疫层析试纸条是用抗VP72 蛋白单克隆抗体研制而成的。通过对比实验结果表明，试纸条可以检测病毒的含量是超过104HAU 的样本，通过临床试验可以看出，三种检测方式其准确率不同，检测率最高最准确的是PCR，其次就是检测率达60 % 的试纸条，而抗原间接ELISA 试剂盒仅有48 % 的准确率[4]。

3 分子生物学检测方法

除了免疫学检测技术，还有分子生物学检测法，其检测反应更为精准，更加适用于高通量检测。上文提到OIE 推荐的PCR 检测法是普遍认可的ASFV 检测的“金标准”。对于PCE 的探索国内外学者从未停止，目前甚至出现数字PCR、重组酶聚合酶扩增等方法[5]。

3.1 常规PCR 检测法

常规PCR 检测法针对ASFV 最多能检测的DNA 数值是从几十到上百。通过VP72 基因设计而建立起的常规PCR 检测法是可以检测到0.12HAU50浓度的ASFV，而且其特异性表现良好，是OIE 推荐的检测方法。

除可以单独检测ASFV 的方法，更有检测多种病原的PCR 检测方法。如可以同时对ASFV、猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒和为狂犬病病毒进行检测的多重PCR 法[6]。

3.2 荧光定量PCR 检测法

荧光定量PCR 检测法比常规PCR 检测对于基因片段的扩增更短，不仅反应快速，而且最低检出的限度可以从几个到几十个拷贝的DNA 模板。在操作时不用开盖的优点降低了扩增产物被污染的可能性，因此是现今ASFV 检测被使用频率最高的方法。

3.3 恒温扩增检测法

近几年，分子诊断技术越来越成为研究重点，恒温扩增检测技术应运而生。其优势在于可以降低实验操作成本，不用通过造价较高的热循环设备，只需使用普通的水浴设备就可以在单一温度中进行测试，而且反应迅速；在检测时肉眼直观的可以根据体系中染料色彩变化或者时试纸条上检测线来分辨结果，是一种可以现场完成测试的检测方法[7]。

4 小结

综上所述，依据我国对于ASF 防控政策，对于ASFV 的分离和鉴定还没有完全放开，只能在特定的实验室进行，尽管试纸条和ELISA 这样的检测方法既便利又快捷，但是受制于检测限，也只能用来检测急性病例和病死猪而已。对非洲猪瘟的防控研究，还有很长的一段路要走，希望在未来的科学研究中，能够早日打破现在的局面，让抗疫疫苗早日面世。