酵母重组表达PCV2病毒样颗粒的纯化工艺

谢 晋，杨德强，周峻岗，李翊峰，吕 红

(1.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438；2.无锡药明生物技术有限公司，江苏 无锡 214092；3.复旦大学 生命科学学院 上海工业菌株工程技术研究中心，上海 200438；4.上海药明生物技术有限公司，上海 200131)

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属圆环病毒科圆环病毒属，为已知最小的感染哺乳动物病毒，包含一个循环的单链DNA基因组.猪圆环病毒2型(PCV2)是引起5～12周龄的断奶仔猪发生多系统衰竭综合征(Post-Weaning Multisy-stemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原.通常该病在养猪场的发病率为20%～60%，死亡率约为5%～35%[1].PCV2相关的疾病正严重影响产猪国家的经济[2].

PCV2病毒颗粒是一个直径约20nm的20面体且为非包膜结构[3].PCV2的开放阅读框区域2(Open Reading Frame 2,ORF2)编码一个约30kDa左右的病毒衣壳蛋白Cap[4].病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs)是由病毒的一种或几种结构蛋白组装而成的与病毒颗粒类似的结构颗粒，但不含病毒核酸，不能进行自主复制.PCV2病毒VLPs由衣壳蛋白Cap组装而成，其与完整的PCV2颗粒相似，可作为一种重要的PCV2免疫原.用其制备的VLPs疫苗可诱导猪免疫系统产生抵抗PMWS的保护机制[5-6]，且免疫原性良好[7-8].鉴于VLPs与天然病毒结构的相似性、无感染性、良好的结构稳定性、出色的免疫原性以及良好的结构可塑性、独特的承载DNA及其他分子的能力，VLPs相关技术在生物医学基础研究、新型疫苗开发、新型药物递送载体开发及基因治疗中具有广阔的应用前景[1].

目前，PCV2 Cap VLPs的纯化通常采用氯化铯或蔗糖超速离心法[9-12].但在大规模纯化生产中，超速离心法将会随着规模的扩大受限于硬件以及劳动强度的增加[13-14].色谱层析分离方法，包括离子交换层析[17-19]、疏水相互作用层析[18,20]、羟基磷灰石层析[19]等，被认为是一种可替代氯化铯或蔗糖超速离心法的纯化方案，广泛应用于病毒和VLPs的纯化.但在应用于纯化酵母胞内表达的VLPs时，酵母破碎之后样品中含有大量的细胞碎片(其主要成分包括蛋白质、糖蛋白、多糖、多磷酸脂类和核酸等[21])，限制了该方法的使用.通过离心的方式可以有效分离大片段的细胞碎片，但仍然有微小的细胞碎片悬浮于上清之中形成混合液，表现为离心上清浊度较高，VLPs的得率较低，容易造成层析柱的堵塞并且增加层析柱清洁处理的难度从而影响层析填料的使用寿命[21].Mindaugas等学者研究表明，酵母表达PCV2 Cap蛋白使用Q Sepharose XL填料作为第一步层析可去除部分宿主细胞蛋白及残留DNA，第二步层析采用阳离子层析可进一步去除杂质，即使在比较好的条件下使用CIMmultus SO3填料纯化也只能得到纯度约为40%的PCV2 Cap VLPs蛋白，收率为15%～18%[22].目前可用的澄清方法有物理过滤和化学处理：物理过滤主要包括深层过滤和中空纤维过滤等方式；化学处理包括酶降解、有机溶剂/表面活性剂处理等方法.

本研究通过考察中空纤维过滤、酶降解和有机溶剂/表面活性剂作用等方法的澄清效果，建立起一套新的澄清方法以解决纯化过程中破碎后菌液浊度过高的问题.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重组PCV Cap蛋白马克斯克鲁维酵母KM-PCV2(K.marxianusFim-1ura3Δ/pUKDN125-Cap)为本实验室保存[23].

1.1.2 主要仪器设备

超声细胞破碎仪(JY92-ⅡN)，宁波新芝生物科技股份有限公司；FastPrep-24均质破碎仪,美国MP公司；JN3000高压均质机，Jnbio广州聚能纳米生物科技有限公司；蛋白质纯化系统AKTA purify100，美国GE healthcare公司；Talos L120C透射电子显微镜，美国Thermo fisher公司；低温离心机CF15RN，Hitach日立株式会社；1260 Infinity高效液相色谱仪，安捷伦公司.

1.1.3 主要试剂

Triton X-100购自Life Sciences公司,SP Bestarose FF填料购自博格隆(上海)生物技术有限公司；酸洗玻璃珠(200μm)购自Sigma公司；其他试剂购于国药集团上海试剂公司，均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 酵母细胞破碎

KM-PCV2菌株发酵制备方法参照文献[23]，发酵液5000r/min离心10min收集酵母细胞，用磷酸缓冲液(50mmol/L Na2HPO4,100mmol/L NaCl,pH 6.8)进行重悬.酵母细胞超声波破碎采用宁波新芝超声波细胞粉碎机，取1mL酵母细胞重悬液，调节功率54%(350kW)，总工作时间25min，工作时间3s/次，间歇5s.玻璃珠研磨破碎采用MP FastPrep-24破碎仪，取0.5mL酵母细胞重悬液，加入约0.2mL酸洗玻璃珠，转速5.5m/s，工作时间60s.高压均质机破碎菌体，温度4℃，压力1100～1600bar.将破碎后的菌液稀释至合适的浓度，取0.1mL系列稀释后样品均匀涂在酵母培养基YEPD平板上，30℃培养2d计数形成菌落数，计算该菌落数与菌液破碎前菌落数的比值，用此数值表示细胞的破碎率.酵母细胞破碎液经10000g离心30min后，上清和沉淀样品与5×SDS-PAGE Loading buffer(250mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),10% SDS,0.5%溴酚蓝,50%甘油，5% β-巯基乙醇)混匀后放入沸水加热10min，待冷却后每孔加入准备好的样品20μL或Page ruler预染蛋白Marker 7μL，以纯化PCV2 Cap蛋白作为参照，用SDS-PAGE电泳检测PCV2 Cap蛋白，对电泳凝胶扫描图采样的背景灰度值与纯化Cap蛋白灰度值进行对比，从而相对定量PCV2 Cap的蛋白浓度.

1.2.2 酵母细胞破碎液的澄清

离心后获得的上清液分别加入0.1%～1%(体积分数)的有机溶剂(甲醛、乙醇、乙酸乙酯、氯仿)、表面活性剂(聚山梨酯-80 Tween 80、聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100、十二烷基硫酸钠SDS、十六烷基三甲基溴化铵CTAB)和化学试剂(硫酸镁和硫酸锌)等，30℃处理2h后10000g离心30min，使用HACH 2100Q便携式浊度仪检测处理前后的浊度，以散射浊度单位NTU(Nephelometric Turbidity Unit)表示溶液中悬浮物的量，1NTU相当于1L的水中含有1mg的SiO2(或是白陶土、硅藻土悬浮体)时所产生的浑浊程度.而处理后上清液和沉淀中PCV2 Cap蛋白的浓度则采用上述的电泳凝胶扫描方法定量.

1.2.3 PCV2 VLPs的离子交换层析

离子交换层析采用装填了400mL SP Bestarose FF填料的XK 50/30柱.层析柱用平衡液(50mmol/L Na2HPO4,100mmol/L NaCl,pH 6.8)平衡，然后将离心澄清的上清液以2.6mL/min速率上样.上样结束后用平衡液冲洗至基线平稳，然后用洗脱液(50mmol/L Na2HPO4,1mol/L NaCl,pH 6.8)洗脱PCV2 VLPs.

1.2.4 PCV2 VLPs的HPLC检测

HPLC流动相为100mmol/L NaH2PO4，100mmol/L Na2SO4，pH 6.7，流速为0.6mL/min.色谱柱采用东曹公司的TSKgel G4000 SWXL column(300mm×7.8mm i.d.)，保护柱为TSKgel SWXL(40.0mm×6.0mm i.d.).上样100μL进样，检测波长280nm，采用峰面积积分法计算PCV2 VLPs的纯度.

1.2.5 PCV2 VLPs的电子显微镜检测

取5μL样品点在铜网上，室温吸附5min后，用滤纸吸干液体，然后滴加3%磷钨酸染液进行负染，用滤纸吸去多余的染液，放置在烤灯下.制好的片子置于透射电子显微镜进行观察，放大倍数为120k倍.

2 结 果

2.1 KM酵母表达PCV2 Cap蛋白的发酵液细胞破碎条件优化

采取超声波破碎、玻璃珠研磨破碎以及高压均质破碎3种方法对KMPCV2 Cap酵母细胞进行了破碎，比较了破碎前后的菌悬液在YEPD平板上的克隆形成数反应细胞破碎率，结果如图1所示，表明3种破碎方法均能达到98%以上的细胞破碎率.采用高压均质破碎酵母细胞时，随着压力的升高细胞的破碎率有显著提升.为了检测不用破碎方法获得的PCV Cap蛋白的量，我们进一步用SDS-PAGE检测了细胞破碎后离心收集的上清和沉淀中PCV2 Cap蛋白的量，以纯化获得的Cap蛋白作为参比，通过灰度扫描的方法，确定破碎后上清中PCV2 Cap蛋白的得率(用上清的数值/上清加沉淀的数值计算得率，用百分比表示).结果(图2，见第688页)发现超声波破碎上清PCV2 Cap蛋白偏低，仅为18.9%，而玻璃珠研磨破碎和1300bar高压均质破碎2次的效果最佳，上清中的Cap蛋白得率分别达到64.8%和64.6%.但由于玻璃珠研磨破碎在工业应用中难以实现工艺的放大，因此在后续工艺优化中采用在1300bar高压均质破碎2次的方法进行重组酵母细胞的破碎.

2.2 添加不同试剂对酵母细胞破碎液澄清的影响

KM-PCV2重组酵母细胞高压均质破碎后浊度较高，即使12000r/min离心20min后浊度依然高于600NTU，为了减少对离子交换层析纯化的影响，本研究采用了在酵母细胞破碎液添加一定量有机溶剂(甲醛、乙醇、乙酸乙酯、氯仿)、表面活性剂(PS80、Triton X-100、SDS、CTAB)和化学试剂(无水硫酸镁和七水硫酸锌)进行处理，然后离心澄清比较处理前后的浊度变化，结果如图3所示.添加0.5% Triton X-100和1%氯仿可以显著降低酵母细胞破碎液的浊度，分别达37%和42%.

进一步比较了不同的氯仿或Triton X-100添加量降低酵母细胞破碎液浊度的效果，结果表明酵母破碎液中加入1%氯仿的澄清效果最佳，破碎液浊度降低约35%(图4(a)).与氯仿相比，添加Triton X-100后破碎液的澄清效果更好，添加了0.1% Triton X-100处理后离心获得的澄清液浊度降低约80%(图4(b))，随着Triton X-100添加浓度的增加，澄清液的浊度呈缓慢下降趋势，Cap蛋白的得率则有所提高.

为了测试Triton X-100对高浊度酵母细胞破碎液的澄清效果，我们将KM-PCV2菌株的发酵液不经离心处理，直接采用1300bar高压均质破碎2次获得含Cap蛋白的破碎液，其浊度为3500～4000NTU，分别加入0.1%～2% Triton X-100处理2h后离心收集上清后测定浊度和Cap蛋白的含量，结果如图5所示.加入1% Triton X-100的浊度能够降低65%以上，并且上清中的Cap蛋白的得率高于90%，说明Triton X-100对高浊度酵母细胞破碎液也有很好的澄清效果.

2.3 Triton X-100澄清处理对离子交换层析纯化PCV2 VLPs的影响

PCV2重组菌细胞破碎液用1% Triton X-100处理后，使用阳离子SP Bestarose Fast Flow介质进行层析分离纯化，并与未添加Triton X-100的样品作为对比，比较Triton X-100澄清处理对PCV2 VLPs的纯度、得率和浊度的影响，结果如表1(见第690页)所示.采用Triton X-100澄清处理后的进行离子交换层析纯化获得的PCV2 VLPs的得率、纯度和澄清度等均优于未作处理组.其中PCV2 VLPs的纯化得率提高2.1%，纯度提高3.8%，浊度降低82.6%，表明Triton X-100澄清处理能显著提高含PCV2 VLPs上清液的澄清效果.Triton X-100处理前后样品的SDS-PAGE检测结果见图6.

表1 Triton X-100澄清处理前后的PCV2 VLPs IEC纯化得率、浊度和纯度Tab.1 The recovery rates,turbidities and purities of PCV2 VLPs by ion exchange chromatography

SDS-PAGE检测IEC上样流穿液中并未发现PCV2 Cap蛋白(图6(a)泳道5，6).采用高效液相色谱进行IEC纯化的VLPs纯度检测，发现添加1% Triton X-100澄清处理后的保留时间10min的峰高显著低于未处理的样品，而它的分子量又明显大于PCV2 VLPs的分子量(PCV2 VLPs保留时间约15min，分子量约1600kDa)，表明该物质可能是影响浊度的大分子细胞碎片(图6(b)).

PCV2 VLPs是由60聚体Cap蛋白组成的病毒样颗粒，为了检测Triton X-100处理是否会影响PCV2 VLPs粒子的构象，我们将IEC纯化获得的样品用透射电子显微镜观察VLPs的形态，结果如图7所示，表明1% Triton X-100处理的纯化工艺样品与未进行Triton X-100处理的样品形态基本一致，并且很好地维持VLPs的状态，没有明显的聚集或其他异常现象.

3 讨 论

酵母细胞破碎可采用机械破碎和非机械破碎[46]，机械破碎包括超声波破碎(Ultrasonication,US)、珠磨破碎(Bead Mill)和高压均质破碎(High Pressure Homogenization，HPH)，但高强度的超声波破碎会导致生物活性的丧失[24].珠磨破碎易破坏蛋白活性且回收率低，易形成极细的细胞碎片增加后续纯化的难度[25]，高压均质破碎常常作为酵母和细菌的工业化生产设备被用于制药和生物技术工厂[26-27].非机械细胞破碎包括电解、酶解、化学和物理方法，电解法易于破坏外膜，但是内膜却很难被破坏[28]，需要与其他的破碎方式联用，而酶解法的高成本是制约其工业生产应用的重要因素[29].物理破碎法如降压法(Decompression)[30-31]一般会产生大片段细胞碎片有利于后续纯化工艺，但是在实际应用中由于有限性、通用性和效率低未被广泛应用.化学破碎一般会引入外源化学物造成下游工艺的复杂度，且高浓度的化学试剂会导致蛋白变性或失活，也未被广泛应用[22].本研究比较了超声波破碎、珠磨破碎和高压均质破碎进行KM-PCV2酵母细胞的破碎，发现超声波破碎上清与沉淀中的蛋白比率很明显偏低，但未能破坏细胞壁和细胞膜释放VLPs，而珠磨破碎和高压均质破碎均有获得较高产量的VLPs释放，但考虑到工艺的放大实施，KM-PCV2酵母细胞的破碎采用高压均质破碎.

利用酵母生产病毒样颗粒疫苗时进行细胞破碎释放VLPs，但在高压破碎后产生大量的细胞碎片，通过离心澄清仍然留有微小片段的细胞碎片悬浮于上清之中形成混浊液，易堵塞层析柱并影响层析填料使用寿命[22].本研究通过对比多种可用的澄清方法，包括深层过滤和中空纤维过滤等通过膜孔径大小截留的物理分离方式，以及酶降解、有机溶剂/表面活性剂处理等化学方法，发现Triton X-100处理可以有效降低破碎后离心上清液的浊度.Triton X-100是一种典型的非离子型表面活性剂，包含一个芳香基团、一个聚氧乙烯亲水链和一个疏水的烃链.Triton X-100分子在溶液中且非常低的浓度状态下会形成胶束[32-34]，这种胶束被广泛用于增加活细胞膜的透性[35-37]，从溶解产物中提取蛋白和细胞器，溶解或稳固生物膜的组分或蛋白[38-41].Triton X-100有能力重排多相性溶液中的脂类混合物[39]，从而影响脂类物质在溶液中的分布.Ribeiro等报道了一些脂类物质可以与Triton X-100形成难溶的溶胶[42]，从而可以通过离心方式予于分离[43-44].这些Triton X-100难溶的脂类物质包括DIG(Detergent-Insoluble Glycolipid)、TIFF(Triton-Insoluble Floating Fraction)、GEM(Glycolipid Enriched Membranes)以及富含鞘磷脂和胆固醇区域的胞膜[45-48].在KM-PCV2细胞破碎液用Triton X-100澄清处理前浊度很高，加入Triton X-100离心可以发现有新的固定沉淀产生，说明在Triton X-100的作用下微小的细胞碎片聚集成更大颗粒从而可以离心分离，与之前的研究报道相一致.

自1998年发现PCV2病毒以来，这种无包膜的环状DNA病毒被全球认为是猪群中最重要的病原体之一，每年都给猪养殖业带来重大的经济损失，每年的疫苗需求量日益增加.2003年猪圆环病毒从2a型进化到2b型，而近年来发现2d型已经成为流行性毒株，可见PCV2病毒进化率的频率非常之高.目前商业化的疫苗集中为治疗PCV2a和2b两个基因型，因而对缩短PCV2的研发周期和生产工艺成熟稳定且成本低易于商业化实施要求越来越强烈.在PCV2的疫苗制备的多种表达体系中，酵母表达体系在各方面均展现良好的发展前景，然而酵母生产PCV2疫苗的工艺包括细胞破碎、澄清以及层析纯化，其中适用于工业生产的破碎工艺以及破碎杂质的分离成为纯化工艺难点.本研究针对酵母细胞进行高压均质破碎(1300bar高压，破碎两次)以及破碎样品分离(细胞破碎液用1% Triton X-100处理)进行了研究，提供了有效降低破碎后中间产品浊度的方案，使用阳离子SP Bestarose Fast Flow层析分离，得率在92%以上和HPLC纯度在85%以上，为酵母表达猪圆环病毒类病毒颗粒疫苗提取纯化工艺以及工业化批量生产奠定基础.