超高压均质对牛乳中微生物和酶的影响研究进展

艾正文

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养物质，因此是微生物生长繁殖的良好基础。牛乳在运输、贮藏及加工过程中极易混入微生物，其中包括分解蛋白质和脂肪的细菌以及酵母和霉菌等。此外，牛乳中还含有蛋白酶、脂酶等多种生物酶。这些微生物和酶对食品安全和产品保质期都会产生较大影响。目前通常采用热处理的方式将牛乳中的微生物和酶灭活，以达到保证食品安全和延长保质期的目的。常用的热处理杀菌方式有巴氏杀菌、高温杀菌、超高温杀菌及超瞬时杀菌等[1]。传统的高压均质作为一种颗粒微粒化手段，在减小颗粒粒径、防止产品分层、增加体系稳定性[2]及提高产品品质[3]等方面具有广泛应用。近些年，随着耐压材料的突破以及制造工艺的进步，均质压力由常规的20～100 MPa，最高可提高至400 MPa以上的超高压力[4]。与传统热处理和高静压杀菌方式相比，超高压均质杀菌具有对热敏性成分损失小、能耗低、可连续化生产等诸多优势[5]。因此超高压均质的应用研究目前也成为热点，本文综述超高压均质对液体食品，特别是牛乳中微生物和酶的影响，为超高压均质在杀菌和灭酶中的应用提供参考。

1 超高压均质杀菌和灭酶机理

流体在超高压均质时，大致会经历4 个阶段，即紊流区、空化区、内爆区及凝聚区[6]。当物料以超过200 m/s的速率通过几微米到几十微米的均质阀，均质带来的剪切、湍流和空化现象急剧增加，产品在处理过程中由于压力的变化，温度瞬间增加[7]，这为液体产品的杀菌和灭酶提供了新的可能[8]。研究表明，均质压力每增加100 MPa，物料温度提高16～20 ℃，但是物料在均质阀中保留的时间极短（0.1 s左右），因此相较于超高温灭菌，物料在超高压均质中受到的热负荷相对更低[9]。从超高压均质和超高温杀菌不同温度和时间下的微生物致死曲线可以看出，超高压均质要达到理想的芽孢灭活窗口条件，均质阀中物料瞬间温度可能要不低于145 ℃（t≥0.1 s）[9]，嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌可以作为评价超高压均质杀菌是否彻底的指示菌[10]。

牛乳中酶的数量超过60 种，主要来源于牛乳腺组织及血浆中，还有相当一部分酶由乳中各种微生物分泌产生。酶在食品加工和贮藏过程中会导致食品发生一些不良的风味和相的变化，从而影响产品的货架期[11]。通常酶具有四级结构，在自然状态下呈现一定程度的折叠和卷曲，高压均质时由于巨大的剪切力和空化作用以及随之产生的温度变化，会使蛋白质的二、三、四级结构发生不同程度解聚[12]，发生不可逆的展开和凝聚，从而导致酶的失活。但是不同的酶对压力耐受程度则表现不同，对于诸如中性蛋白酶等压力敏感的酶，即使在50 MPa左右压力下也会失活变性。此外，部分酶在低压条件下（通常100 MPa以内），经超高压均质处理后酶活会有比较明显的提升，这可能与处理后暴露了酶的活性位点有关[13]。

2 超高压均质对牛乳中微生物灭活的影响

目前，随着我国奶牛养殖条件的改善，原料乳中细菌总数大幅降低，接近或部分已经低于欧盟标准，但是仍然无法避免牛乳受到微生物的污染。原料乳中的微生物种类大致可以分为3 类：1）病原微生物，如沙门氏菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌及可能存在的布鲁氏菌等；2）诸如蛋白分解菌、脂肪分解菌及芽孢菌等引起乳制品腐败变质的腐败菌；3）一些有益或者无害的微生物，如乳酸菌等[14]。超高压均质带来的强大机械力会导致微生物细胞膜破裂，以及动能带来的温度激变引起细胞内的蛋白质变性，从而达到灭活微生物的目的。现有研究显示，微生物种类及处理条件均影响超高压均质的灭菌效果。Peredal等[15]研究表明，牛乳进样温度为40 ℃、均质压力达到300 MPa时的灭菌效果与常规热处理杀菌（90 ℃、15 s）效果基本一致，灭菌效率可以达到99%。相似地，当生乳的进样温度为55 ℃和70 ℃，均质压力超过200 MPa时，超高压均质均具有良好的灭菌效果，经过处理的生乳细菌总数、嗜冷菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌均未检出，但是样品在4 ℃条件下保存14 d，其细菌总数、嗜冷菌、假单胞菌数量均超过7（lg（CFU/mL）），超高压均质在延长牛乳货架期方面仍存在一定局限性[16]。同时，牛乳中还含有嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等芽孢菌及其孢子。目前商业化纯牛乳产品必须经过超高温灭菌（137～145 ℃、3～7 s）才能达到商业无菌，主要原因在于芽孢及其孢子十分耐热，只有高强度热处理才能将芽孢灭活。现有超高压均质处理，单一的均质压力对微生物，特别是芽孢的灭活能力有限。Sevenich等[9]研究表明，当进口温度超过一定温度后（＞80 ℃），结合300～350 MPa压力，可以达到灭活芽孢的目的，而微生物灭活的主导效应可能是压力增加带来的急剧温度变化（出口温度＞140 ℃）。

随着研究的深入，除了均质温度和均质压力能够直接影响杀菌效果，超高压均质设备均质阀的几何结构同样会影响灭菌效率。Donsi等[17]研究表明，柱塞阀对大肠埃希氏菌、德氏乳杆菌及酿酒酵母的灭活效率高于孔板阀，主要的原因可能在于柱塞阀的间隙更小（3～14 μm），相对于孔板阀（130 μm左右）产生的空化作用更加强烈。超高压均质对牛乳中微生物影响的部分研究如表1所示。

表 1 超高压均质对牛乳中微生物的影响Table 1 Effect of ultra-high pressure homogenization on sterilizing microorganisms in milk

3 超高压均质对牛乳中酶灭活的影响

牛乳中天然含有溶菌酶、乳过氧化物酶和磷酸酶等酶系。此外，牛乳中的微生物还会分泌产生蛋白酶和脂酶等生物酶，这些酶对牛乳的品质具有重要影响。研究表明，牛乳中的溶菌酶和乳过氧化物酶具有天然的抑菌活性[24]，但是其中部分蛋白酶和脂酶是造成牛乳凝结、口味发苦和变质的重要因素。超高压均质对食品中酶的处理研究起步相对较晚[13]。dos Santos Aguilar等[25]研究表明，均质压力可以改变酶的结构，使氨基酸和巯基基团暴露，从而影响酶的功能。酶的四级结构在相对较低的压力下就可以发生解离，当压力超过150 MPa及出口温度较高时，酶的二级结构中的氢键和二硫键会随之发生变化，但是超高压均质对酶的一级结构几乎没有影响，即目前无法破坏共价键[26]。超高压均质作为一种新兴的、潜在的可替代传统热处理的加工方式，其对牛乳中酶的影响也逐渐得到深入研究。

3.1 碱性磷酸酶

在乳品工业中，由于碱性磷酸酶的失活温度略高于牛乳中致病微生物灭活的温度，当生牛乳在加工过程中碱性磷酸酶失活意味着牛乳中全部致病菌在热处理时已被灭活。因此，碱性磷酸酶可以作为一种指示酶，它是判断巴氏杀菌乳杀菌效果的重要参考指标[27]。研究表明，碱性磷酸酶相对不耐热，在70 ℃条件下加热16 s左右就基本完全失活[14]。但是，与热处理不同的是，通常当均质压力处于较低水平时，大多数酶活力明显升高。Picart等[28]研究表明，当均质压力100～150 MPa、进口温度24 ℃时，碱性磷酸酶活性有一个增加的过程，但是当均质压力升高至270 MPa时，碱性磷酸酶活性显著减少约91%。Pinho等[29]的研究结果也显示，均质压力超过270 MPa后，碱性磷酸酶基本全部失活。此外，超高压均质对碱性磷酸酶的灭活效率与样品的进口温度具有相关性。通过预热并结合压力可以显著提高超高压均质的灭酶效率，当样品进口温度达到50 ℃以上，200 MPa压力条件下就可以使碱性磷酸酶钝化。同时，相对于均质压力，温度对碱性磷酸酶活性的影响更大[30]。

3.2 乳过氧化物酶

乳过氧化物酶是牛乳中天然存在的一种单肽链蛋白质，它具有天然抑菌特性。研究表明，乳过氧化物酶系在生鲜乳保鲜中发挥着重要作用[31]。乳过氧化物酶相对比较耐热，其失活条件为72 ℃、1.5 min，或超过80 ℃、几秒钟就可以失活[32]。超高压均质对乳过氧化物酶的活性具有双面性。低压条件下（75、100、130 MPa，进样温度37 ℃）可以提高乳过氧化物酶的抑菌活性[33-34]。然而当均质压力达到200 MPa、样品出口温度超过60 ℃时，乳过氧化物酶开始失活，出口温度超过80 ℃时则完全失活[30]。

3.3 溶菌酶

溶菌酶是牛乳中另一种抗菌酶类，可催化细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，从而引起细菌溶解。溶菌酶经过适当的超高压均质处理，可以提高其抗菌活性[35]。Tribst等[36]研究表明，pH 6.5、20 ℃、120 MPa时溶菌酶的活性明显高于其他实验组。这可能是由于高压均质后溶菌酶疏水基团暴露[37]。此外，溶菌酶结合超高压均质可以提高压力对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果，通过透射电镜可以观察到细菌总数的下降，不仅仅是由于均质压力对细菌细胞壁或细胞膜的作用[23]。

3.4 其他酶类

相较于碱性磷酸酶和乳过氧化物酶，针对牛乳中蛋白酶和脂酶等酶的超高压均质研究相对较少。Datta等[38]对生牛乳中的脂酶和纤维蛋白溶解酶经过超高压处理后的酶活进行研究，研究表明，预热协同超高压处理可以有效降低牛乳中的脂酶和纤维蛋白溶解酶活力，此外，相对于热处理，纤维蛋白溶解酶对均质压力更敏感，200 MPa时样品出口温度超过74 ℃时，纤维蛋白溶解酶失活超过90%。假单胞菌作为牛乳中一种常见的嗜冷菌，其产生的胞外蛋白酶能使乳制品中的蛋白质分解变质，从而影响产品的货架期[13]。超高压均质对假单胞菌蛋白酶同样具有一定的灭活作用。150 MPa压力下生乳样品（脂肪含量3g/100 g）中的假单胞菌蛋白酶可减少51%，但是对脱脂乳中的假单胞菌产生的蛋白酶水解无明显抑制作用，可能的原因是牛乳中的脂肪球经过超高压均质处理后，脂肪球碎片吸附在蛋白质表面可以显著抑制牛乳蛋白质的水解[39]。

超高压均质对牛乳中酶影响的部分研究如表2所示。

表 2 超高压均质对牛乳中酶的影响Table 2 Effect of ultra-high pressure homogenization on inactivating enzymes in milk

4 结 语

超高压均质作为一种新兴的加工方式，在生物、医药及食品领域的应用越来越广泛。由于超高压均质可以连续化生产及热负荷较低等优势，相对于静态超高压处理优势更加明显。目前在乳制品加工领域，超高压均质在杀灭牛乳中的微生物方面已表现出潜力，其已成为一种潜在的可替代传统热处理的加工方式。同时，牛乳中的各种内源性或外源性酶对产品品质的影响仍然不容忽视。如果超高压均质的加工参数仅考虑微生物安全性，仍无法达到保证食品安全和延长产品货架期的目的。未来超高压均质在乳品中的应用必须要同时兼顾微生物和酶的处理效果。目前超高压均质虽然仍然存在一定局限，例如，现有条件很难完全杀灭牛乳中的芽孢和孢子，同时超高压设备造价很高、均质压力和单位时间处理能力仍有待进一步提高。