NOS3串联重复序列多态性与Hcy及冠心病的相关性分析

赵唱，贺欣

（1.阜新市中心医院心内科，辽宁 阜新 123000；2.锦州医科大学第一附属医院心内三科，辽宁 锦州 121000）

近年来，研究发现同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）和糖尿病、高血脂一样，是心脑血管疾病的另一独立危险因素，其与CHD的关系受到临床广泛关注[1]。心血管疾病常常也与内皮一氧化氮合成酶（NOS3）基因多态性相关。NOS3为一氧化氮（NO）合成途径的关键酶，NO的生成受eNOS的影响，故心血管疾病的候选基因为eNOS[2]。eNOS 基因多态性位点有多个[3]，人们意识到遗传因素在冠心病的发病及发展中的重要作用[4]。本研究旨在探讨NOS3 的基因串联重复序列（VNTR）多态性与Hcy、冠心病的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年12月至2019年10月于本院住院和门诊就诊的经冠状动脉造影153 例患者为CHD 组，同时收集体检志愿者149名作为对照组。冠心病诊断标准：中华医学会急性非ST段抬高型ACS诊断和治疗指南及急性ST段抬高型心肌梗死诊断与治疗指南中颁布的ACS诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 实验室检测方法 采集空腹12 h以上外周静脉血置于EDTA 抗凝，血浆-80 ℃冻存待测Hcy，血细胞作提取DNA用。Hcy通过用酶循环法测定（上海科华卓越生化分析仪），检测试剂批号：14030403（北京中生公司）。通过全自动生化仪（BeckmanDXC800）测定血脂、肾功、血糖。

1.2.2 DNA检测方法 试剂和仪器：采用人外周血DNA提取试剂盒（德国QIAGEN 公司），提取人基因组DNA，采用Nano-Drop检测基因组DNA浓度，基因组DNA置于-80 ℃贮存，应用毛细管凝胶电泳检测NOS3 VNTR 基因多态性。PCR 引物为：上游5’-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3’，下游5’-TCTCT-TAGTGCTGTGGTCAC-3’。PCR体系为：基因组DNA模板100 ng，上下游引物各2 μL，2×PCR MIX 25 μL，用ddH2O补足至50 μL。PCR 反应温度设置如下：94℃变性8 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环，72 ℃延伸8 min，PCR 产物4 ℃贮存。PCR 产物采样毛细管电泳检测片段大小，出现420 bp DNA 片段提示为5 个重复序列的NOS34b 等位基因，出现393 bp DNA 片段则提示为4 个重复序列的NOS34a 等位基因。酶切体系为内切酶1 μL，10×Hbuffer溶液2 μL，PCR 产物6 μL，加ddH2O 补足至20 μL。37 ℃金属浴酶切，酶切片段用毛细管电泳检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，计量资料采用“±s”表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料采用χ2检验。基因型频率的分布采用Hardy-Weinberg平衡χ2检验；采用二元Logisitic回归模型分析等位基因OR值。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NOS3 VNTR基因多态性对血浆Hcy的影响 302例受试者经过PCR 和电泳，NOS3 VNTR 等位基因4b 可产生420 bp 的片段，其中有27 bp 重复，而等位基因4a 有一种393 bp 的片段，有4 次重复。因此，纯合子4b/4b 和4a/4a 分别有一个420 bp 和393 bp 片段，杂合子4b/a 有420 bp 和393 bp 的片段，杂合子4b/a 有420 bp 和393 bp 的两个片段。4a 等位基因在CHD 组中的频率明显高于对照组中的频率[23.2%（71/306）vs.14.1%（42/298），P=0.003]，见表1。NOS3 基因多态性与Hardy-Wenberg 平衡相符合，具有群体代表性。NOS3 VNTR 依据基因型进行分组，比较两组人群中各基因型血浆Hcy 水平，对照组中，4a4a 基因型组血浆Hcy 水平（14.96±4.03）μmol/L，4a4b 基因型组血浆Hcy 水平为（13.68±4.06）μmol/L，4b4b 基因型组血浆Hcy 水平为（13.28±3.88）μmol/L，Hcy 水平在上述3 种基因型中差异无统计学意义（P=0.718）。CHD 组中，4a4a 基因型组血浆Hcy 水平为（23.67±3.71）μmol/L，4a4b 基因型组血浆Hcy 水平为（18.51±4.60）μmol/L，4b4b 基因型组血浆Hcy 水平为（16.32±5.07）μmol/L，比较3 组基因型的Hcy 水平可知4a4a 基因型最高（P=0.002），见表2。在4a4a 基因型、4a4b基因型和4b4b基因型3组中的CHD组Hcy含量均显著高于相应基因型的对照组，见图1。

表1 NOS3VNTR基因多态性Table 1 NOS3VNTR gene polymorphism

表2 NOS3 VNTR基因型比较Table 2 Comparison of NOS3 VNTR genotypes

图1 3组不同基因型Hcy含量比较Figure 1 Comparison of Hcy content of three different genotypes

2.2 NOS3 VNTR 基因多态性对血浆CHD 的影响 NOS3 VNTR基因型中，①4b4b 在冠心病组中所占的比例为60.1%，远低于对照组的73.8%。②4a4b 在冠心病组中所占的比例为33.3%，远高于对照组的24.2%。③4a4a 在冠心病组中所占的比例为6.5%，高于对照组中的2.0%，差异具有统计学意义（P=0.017）。④4a 等位基因在冠心病组中的比例为85.9%，远高于对照组的76.8%。4a 等位基因频率在上述两组中差异有统计学意义（P=0.003），见表3。

表3 NOS3各个基因型的分布Table 3 Distribution of NOS3 genotypes

使用NOS3 VNTR（4a/4b）的3种不同基因型作为独立变量，以各基因座的野生型纯合子为基准，其他基因型为虚拟变量，拟合二元Logistic 回归模型。4a4a 基因型增加冠心病的风险[OR=1.772，95%CI（1.552～1.992），P＜0.05]，见图2。

图2 NOS3 VNTR风险与冠心病的关系Figure 2 The relationship between the risk of NOS3 VNTR and coronary heart disease

3 讨论

动脉粥样硬化的主要机制为NO系统的功能障碍使损伤内皮受损，而这一过程有Hcy 的参与，NO 是由精氨酸在NOS3催化下生成的[5]。NOS 蛋白的功能及活性降低可使NO 合成减少，进而促进动脉粥样硬化的发生。而NOS蛋白受NOS3基因不同部位突变的影响，有研究显示，NOS3 基因的第4 个内含子的4a4b位点与个体内血清NOS3活性水平相关[6]。已有研究认为，Hcy对eNOS活性和NO释放有抑制作用[7]。NO含量可反应患者冠状动脉内皮功能的冠脉血流速度储备（CFVR）在慢性高同型半胱氨酸血症（HHcy）患者血浆中显著降低[8]。本研究显示，在冠心病患者NOS3 VNTR3种基因型中，4a4a基因型与冠心病患者血浆Hcy水平呈正相关。在对照组中，血浆Hcy水平在NOS3 VNTR3种基因型中差异无统计学意义，可能是因纳入本研究的4a4a基因型病例数较少所致。本研究中对照组的结论与Dayal[9]一致。Thomas等[10]研究发现3种基因型个体呼出NO水平依次降低，其中4a4a呼出NO水平最低，4b4b 呼出NO 水平最高，故认为eNOS 水平和细胞内NO 合成效率受该位点影响，NO 减少受eNOS 表达下调影响。VNTR 4a4b位点位于eNOS3基因的第四内含子区，通过比较CHD组和对照组可知，4a 等位基因频率前者中明显高于后者，与Wang 等[11]研究相符合，4a 基因位点与786C 位点存在连锁不均衡，他们影响NOS3基因的转录效率。

大量研究结果表明，eNOS 可能与CHD的发病有关[12-13]。有报道称，血浆NO 含量和具有4a 等位基因的人群有关，4a等位基因人群中NO含量低于无该等位基因人群。Wang等[11]首次通过病例对照研究提出4a等位基因与内皮功能紊乱有关。Li等[14]的一份无发表偏倚的Meta分析显示，4a/4b突变体无显著性相关。本研究经过仔细分析各组可知4a4b位点的基因型及等位基因频率差异具有统计学意义（P＜0.05），提示具有4a 等位基因和4a4a 基因型的人群更易患CHD，与既往国内外研究结果相吻合。但也存在与上述不同的结论[15]，可能由于研究对象为不同种族[16]或者相同种族不同民族间存在的遗传、生活方式、环境因素、饮食差异所造成的，由于NOS3基因多态性重要的临床意义，故需要进一步探索。

本研究仍有很多不足之处，仅涉及本地区人群基因类型，不包含其他地区及种群基因情况。下一步研究希望增加样本量，以验证可靠性。