肺泡发育及其相关信号通路

陈俏媛，林万华

(广西高校干细胞与医药生物技术重点实验室(广西师范大学 生命科学学院)，广西 桂林 541004)

肺是一个复杂的器官，由气管、支气管、细支气管和肺泡组成[1]。在发育过程中，原始肺经历分支形态发生，形成近端导气管和远端气体交换肺泡腔[2]。成年小鼠肺含有几种不同的上皮细胞群，具有独特的解剖位置和特殊功能(见图1)[3]。近端气道包括软骨气管，由假复层柱状上皮细胞排列，包括有分泌功能的CCSP+Clara细胞，能产生粘液的杯状细胞(Goblet cell)和具有宿主防御功能的FoxJ1/Actub+纤毛细胞(Ciliated cells)。非软骨细支气管，衬有简单的柱状上皮，以有组织的模式从气管分支。分泌性Clara细胞还将气道的基底膜与纤毛，神经内分泌细胞和goblet细胞群排列一致[4]。在上皮的基底边缘是NGFR+/p63+基底细胞，其被认为能够在修复和培养期间产生Clara和纤毛细胞。在较远端的细支气管中，有纤毛和克拉拉细胞散布着CGRP+神经内分泌细胞。神经内分泌细胞单独存在以及称为神经内分泌体的簇，其可能在感测气道腔内的刺激中起作用[5]。末端细支气管形成远端肺泡腔，其含有产生表面活性剂的肺泡II型(AT2)细胞和气体交换的肺泡I型(AT1)细胞[6]。表达T1α和水通道蛋白5(Aqp5)的肺泡上皮1型细胞(AT1细胞)和SPC+肺泡上皮2型细胞(AT2细胞)排列发生气体交换的肺泡空间。在支气管肺泡(Brochioalveolar)管道交界处，称为在支气管肺泡上皮细胞(BASC)，认为BASC能够在受伤后产生Clara和AT2细胞谱系。

(引自LEEMAN K T, et al, 2014[3])图1 肺中的细胞类型Fig.1 Cell types in lung

肺发育分为胚胎期，胎儿期和产后，每个阶段都至关重要，若异常发育会引起胎儿肺发育不全甚至死亡(见表1)。

在肺泡发育的过程中，涉及到一组进化上保守的核心信号通路，由WNT、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)和维甲酸(Retinoic acid，RA)等驱动的信号通路组成，其中维生素A是调节肺分化成熟的主要因素，而且它的活性代谢物维甲酸(RA)是胚胎发育和出生后肺泡化的关键调节因子。此外，WNT信号通路和FGF信号通路对于气道分化和肺泡形成也是很重要的。WNT信号通路的抑制促进了HSC(造血干细胞)的发展；WNT信号通路也促进AT2细胞生长并抑制肺泡发生期间AT1细胞的分化；在肺泡形成过程中WNT信号通路还具有平衡AT2-AT1细胞比例的作用[17-22]。FGF信号通路是肺泡再生所必需的[23]。成年鼠远端肺中有多个干/祖细胞群，包括基底细胞、支气管肺泡上皮细胞(BASCs)、Club细胞、AT2细胞。在肺泡中，肺泡Ⅱ型(AT2)细胞群或其中的AT2sAxin2亚群被认为是主要的上皮祖细胞，能够在损伤后自我更新和产生肺泡Ⅰ型(AT1)细胞[22-26]。通过下调RA信号通路能够完成肺上皮祖细胞分化程序的后续步骤，最终形成成熟的I型和II型细胞[27]。

1 肺泡发育：肺发育的高潮

在肺部发育期间，必须形成导气管和较大的气体交换表面积，以向生物体提供足够的氧气并去除二氧化碳。肺发育包括三个主要不同的机制。首先，呼吸道的传导以及部分呼吸是由分支形态发生形成的。其次，在肺泡化过程中，在已存在的隔膜增加新隔膜，气体交换表面会进一步扩大，并将现有的空域细分为较小的单元，即肺泡。第三，为优化气体交换，将所有隔膜的双层毛细血管网络减少为单层毛细血管网络(微血管成熟)。

肺泡发育始于妊娠晚期，因为内皮丛与远端上皮囊紧密相关。底部是带有球囊的末端细支气管，而顶部面板在移除球囊以显露内腔后具有更高的放大率。在E16.5左右，小鼠的肺发育从分支形态发生转变为小管期和囊状期。这些导致最终的肺泡形成过程(也称为肺泡形成)，产生用于气体交换的功能单元(见图2)[2]。原始肺泡发育的时间因物种的不同而不同。在小鼠中，它发生在E17.5～P5，但在人类中，一些原始肺泡在出生前就已经形成，而且这个过程在出生后持续了许多月。值得注意的是，极低出生体重早产儿(VLBW)的肺部在分娩时可能仅进展到小管阶段，这突出了保护器官免受损害的临床挑战。几乎没有人知道是什么控制了假腺期的结束，而且对随后的发育背后的形态发生机制仍然知之甚少[28-29]。

表1 肺发育的阶段及其时间尺度Table 1 Stages of lung development and their time scale

在小管期和囊状期，末端或腺泡管变窄，产生小球囊。这些囊壁，即初级纵隔，与血管丛紧密相连，细胞外基质富含弹性蛋白，间质细胞类型尚未明确，包括肌成纤维细胞的前体细胞。发育中的球囊/原发性间隔的上皮细胞分化成在成熟肺泡中发现的几种重要细胞类型。这些包括扁平的AT1细胞(成熟的AT1细胞表达Aqp5和T1α)，以及更大的立方形AT2细胞。这些细胞类型彼此紧密并置，并且AT1细胞与下面的血管内皮形成紧密的相互作用。内胚层开始分化为未来肺泡的两种主要的特殊细胞类型——肺泡上皮I型细胞和II型细胞(AT1和AT2)(见图2)[2]。成熟的AT2细胞分泌丰富的表面活性蛋白和脂质，这些蛋白质和脂质被运输到由ACBC3转运蛋白标记的层状体细胞表面。肺泡室的成熟伴随着次级间隔的产生，其涉及肺泡嵴的生长。在肺泡化的过程中，囊被称为次生隔膜的脊状或尖顶的内生部分。肌成纤维细胞祖细胞和内皮细胞都迁移到这些峰顶，基质蛋白支架被沉积，在顶端富集了弹性蛋白。毛细血管单元最初是双倍的，但随着肺泡的成熟，毛细血管重新形成一个单元，血管内皮细胞紧密地附着在AT1细胞上，从而实现了有效的气体交换(见图2)[2]。因此肺泡形成是肺发育中最关键的步骤之一，需要多个细胞谱系的精确时间和空间协调。这使得该过程特别容易受到细胞应激，子宫内感染甚至营养限制的破坏可能导致诸如肺气肿和肺泡毛细血管发育不良等不易逆转的病症。

(引自MORRISEY E E, et al, 2013[2])图2 肺泡发育示意图 Fig.2 Schematic diagram of alveolar development

2 肺泡发育相关信号通路

2.1 WNT信号通路

WNT家族的分泌型糖蛋白控制着多种发育过程，包括细胞命运指定、增殖、极性和迁移。胚胎发育期间WNT信号的错误调节会导致肺发育缺陷。Wnt分子分为经典类(Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8等)和非经典类(Wnt5a、Wnt4、Wnt11等)[30]。在WNT信号转导过程中，至少有三条信号通路，其中经典的信号通路是依赖于β-catenin的信号通路。在没有WNT信号的情况下，糖原合成酶激酶(GSK-3)是活跃的，磷酸化β-catenin[31]。磷酸化的β-catenin的目的是泛素化和26S蛋白酶体介导的降解，从而降低β-catenin的胞浆水平。在WNT分子存在下，Wnt与细胞表面受体Frizzleds(FZ)及共同受体低密度脂蛋白相关蛋白(LRP)5/6结合，形成Wnt-Fz-LRP6复合物，导致胞浆散乱蛋白三个结构域的磷酸化(Dvl)的激活，抑制GSK-3，使β-catenin稳定，从而导致胞内积累。积累的β-catenin转运到细胞核，在细胞核中β-catenin与T细胞因子家族成员(LEF1TCF1，TCF3，TCF4)[32]、转录因子家族成员PITX2和SOX17[33]和转录启动子p300[34]形成活性转录复合物，激活靶基因，如基质金属蛋白酶(MMP2、MMP3、MMP7和MMP9)[35]、细胞周期蛋白D1[36]、c-myc、c-jun[37]等。

经典WNT信号通路中心分子β-catenin定位于细胞质，也定位于未分化的原始上皮(PE)、分化的肺泡上皮(AE)和邻近的间质的细胞核[38]。β-连环蛋白的条件性基因敲除的研究揭示了β-连环蛋白依赖的信号对于肺的气道的形成是必不可少的，负责进行气体交换[39]。另外，非经典信号通路也很重要。在Wnt5a-/-动物中，肺的形态比野生型要小，并且有增厚的间质，虽然没有阻止肺泡发育，但肺泡发育迟缓[40]。

2.2 FGF信号通路

成纤维细胞生长因子(FGF)信号是调控肺发育的基因调控网络的重要组成部分。FGF配体通过结合和激活单次跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)的FGF受体(FGFR)家族，同时FGF配体与硫酸乙酰肝素的结合[41],稳定Fgf/FgfR信号转导复合物，诱导受体二聚化和受体胞浆激酶结构域中特定酪氨酸残基的转磷酸化，有助于募集配体蛋白，激活FGF下游信号级联，包括MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)，PI3K/AKT(磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶)/AKT和磷脂酶C/Ca2+途径[42],维持祖细胞群体、上皮和间充质的形态和分化以及分支形态的形成。FGF10是初始肺形成所必需要的，表达Fgf10的细胞代表一群间充质祖细胞，它们可以分化为气道和血管平滑肌细胞以及脂肪成纤维细胞[43]。FGF或FGF受体的缺失会导致肺发育异常，FGF10在未来出现肺芽的部位的腹膜下间充质中表达，与表达FGFR2b的上皮细胞结合，通过引发趋化/迁移反应诱导芽突起，并保持远端上皮祖细胞处于未分化状态[44]。缺乏FGF10或其主要受体FGFR2b的小鼠仍然发育气管，但表现出完全的肺发育不全[45]。

FGF调节多种信号传导途径基因的表达。肺间充质中的FGFR信号调节肺间充质中WNT-β-catenin信号的水平。在肺发育的假腺体阶段，FGF和WNT信号通路共同起支持间质生长和协调上皮形态发生的作用[45]。Sonic Hedgehog(SHH)和骨形态发生蛋白4(BMP4)也调节肺间充质和上皮的发育。BMP4在远端上皮中表达，在远端上皮中似乎具有促进远端上皮分化和拮抗FGF介导的上皮出芽的主要作用，BMP4在体外和体内由FGF10上调[46]。在肺中，FGF10和SHH形成反馈环，其中在间充质中产生的FGF10向远端上皮发出信号以上调SHH表达，促进分支，同时SHH反馈以抑制相邻间充质中的FGF10表达[47-48]。在此过程中ETV因子通过作用于FGF此，ETV的损失使得FGF-SHH反馈回路的平衡倾斜，导致分支周期性改变，导致尖端尺寸增加和尖端数量减少[49]。

2.3 NOTCH信号通路

NOTCH信号是一种高度保守的细胞-细胞信号通路，NOTCH信号是通过与相邻细胞直接接触来传输的，非常适合于极短距离的细胞通信。这条通路由4个受体(Notch1，Notch2，Notch3和Notch4)和5个典型配体(Jagged1和Jagged2)，以及Delta样配体(Dll1，Dll3和Dll4)组成。NOTCH受体的胞外结构域受到糖基转移酶介导的修饰，O-岩藻糖基转移酶1(Pofut1)是该途径的一个附加成分，它连接O-岩藻糖与NOTCH受体的EGF重复序列，从而实现有效的NOTCH-配体相互作用。配体与受体直接结合，NOTCH胞内域(NICD)被γ分泌酶从NOTCH受体上切割出来，NICD移位到细胞核中。NICD通过与Rbpj和Maml1-3的相互作用激活NOTCH靶基因的表达，靶基因包括CyclinD1(细胞周期启动子)、c-myc(增殖相关基因)、Bcl-2(抗凋亡基因)、HER-2基因、Deltex-1、p21Cip1/Waf1、Notch调节的锚蛋白重复蛋白(Nrarp)和前T细胞受体基因等[50-51],调控分化、发育、增殖和凋亡。如Hes家族bHLH转录因子1(Hes1)，这是靶向特定DNA位点所必需的[52]。在Hes1缺失的肺中，发现肺神经内分泌细胞(PNECs)群体的扩大和棒状细胞的减少。

NOTCH信号通过调节肺泡上皮分化和毛细血管形成来协调肺泡发育[53]。Jagged1-Notch2信号在编排不同的细胞命运和形成棒状细胞和纤毛状细胞的镶嵌模式中起主要作用，而Notch1在这些过程中起辅助作用[54]。Notch2信号是II型肺泡上皮细胞增殖和成熟所必需的，在远端肺上皮中破坏NOTCH信号会导致PDGF-A的表达减少，而PDGF-A是远端间充质中肺泡肌纤维母细胞(AMYFs)发育所必需的，从而导致肺泡发育缺陷[55]。NOTCH信号是免疫细胞分化和功能的重要调节剂。NOTCH信号参与CD4+淋巴细胞向Th1，Th2，Th17和调节性T细胞的调节和分化。NOTCH对T细胞的作用不仅通过规范的RBPJκ依赖性NOTCH途径，但也通过非RBPJκ的非典型途径，抑制RBPJκ敲除小鼠的NOTCH显着降低了T细胞活化，增殖和分化[56]。具有Th2细胞因子模式的CD4+淋巴细胞在哮喘的发病机制中起着关键作用[57]。此外，许多已知在非小细胞肺癌中起作用的因素通过对NOTCH信号的调节促进或抑制非小细胞肺癌的发展。特别是WNT和转化生长因子-β信号通路在非小细胞肺癌进展和转移过程中的调节作用。

2.4 RA信号通路

维甲酸(RA)是一种由维生素A衍生而来的亲脂小分子，它与其他可扩散的细胞信号因子不同。FGF和WNT等蛋白质因子与细胞表面受体结合，启动细胞内信号通路，而RA通过核受体进入细胞核并直接与目标基因结合，直接影响发育过程。维生素A影响发育的能力是通过酶控制维生素A(视黄醇)的醇形式首先转化为醛(维A醛)，然后转变为羧酸(维甲酸；RA)。视黄醇被肝脏分泌的视黄醇结合蛋白(RBP4)携带于血清中，通过一种特定的受体Ser6进入细胞，而细胞内的视黄醇结合蛋白(Crbp)则促进了视黄醇转化为视黄醇酯，以供储存。在产生RA的组织中，视黄醇被乙醇脱氢酶(ADH)或视黄醇脱氢酶(RDH)氧化为视黄醛[58]，视黄醛被维甲酸脱氢酶(RALDH)氧化为RA。然后RA被释放并被周围的细胞吸收。一些RA靶细胞表达细胞性RA结合蛋白(CRABP)，促进RA的摄取并转运到RA与RA受体(RAR)结合的细胞核。RA是结合DNA并直接调控转录的两个核受体家族的配体：(1)RA受体(RARα、RARβ和RARγ)结合了大量形式的RA，称为全反式RA；(2)维甲酸X受体(RXRα、RXRβ和RXRγ)结合了一个称为9-cis-RA的异构体[59]。RA受体-β缺陷型小鼠在远端空域发育方面存在缺陷，并逐渐丧失呼吸功能。事实上，增加和减少RA信号都会损害肺泡发育[3]。通过在上皮细胞中表达显性活性RARα受体，增加RA信号，导致肺发育不成熟，阻止远端上皮成熟，并且不能识别AT1细胞的发育[18]。相反，维生素A缺乏会损害啮齿类动物的肺上皮功能，并导致人类支气管肺发育不良。另外，RA信号通路的抑制能够通过激活YAP通路和间充质FGF通路刺激小鼠肺上皮细胞增殖，同时也能够抑制肺泡和气道分化。RA需依赖于FGF通路诱导肺泡分隔，而FGF信号通路是肺泡再生所必需的[23]。在肺泡中，肺泡Ⅱ型(AT2)细胞群或其中的AT2sAxin2亚群被认为是主要的上皮祖细胞，能够在损伤后自我更新和产生肺泡Ⅰ型(AT1)细胞[24-26]。通过下调RA信号通路能够完成肺上皮祖细胞分化程序的后续步骤，最终形成成熟的I型和II型细胞[27]。

2.5 其他信号通路

许多信号通路和细胞间的相互作用明显地参与了形成肺泡所需的血管和间质成分的产生和分化。肌成纤维细胞的分化及其弹性蛋白的产生受到Pdgfa的调节。肾上腺素B2(ephrinB2)对血管内皮细胞起着重要的作用,在ehrinB2信号缺陷突变体中，次级隔膜不能正常发育，几种基质蛋白的沉积被破坏[60-61]。

3 结 语

肺是一个复杂的器官，肺泡的发育也是一个复杂的过程。我们需要了解更多关于转录因子和信号通路的信息，因为这些通路是肺泡得以正常发育的关键。最近，研究发现Sdr9c7基因敲除鼠出现肺发育不全导致呼吸困难的现象，下一步拟通过实验弄清楚Sdr9c7是否通过RA、WNT、FGF、及NOTCH等通路影响肺泡发育，进而对肺泡正常发育有新的理解。