HER2靶向载HSV-TK基因并具有核定位效应的纳米超声造影剂制备

张月，周厚妊，罗语岑，辛莹，刘小奇，刘治军

1中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004；2沈阳药科大学药学院

分子靶向超声造影是近年来发展起来的一项新技术，良好的超声造影剂是实现分子靶向超声造影的关键。在过去的几十年里，超声造影剂大多是载着特异性靶向抗体、药物或基因的微泡，用于肿瘤或炎症血管内靶向诊断和治疗，并且得到了广泛的研究。然而，微泡的粒径限制了其对肿瘤血管内皮间隙（380～780 nm）的穿透，使其不能更好地针对肿瘤细胞。因此，为实现靶向性血管外超声分子成像，亟需纳米级超声造影剂［1］。自杀基因疗法对肿瘤细胞有高度选择性，被认为有可能成为一把潜在的对抗肿瘤的利器［2］。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）是目前自杀基因疗法中最为常用且成熟有效的，胸苷激酶（TK）基因是药敏基因，肿瘤细胞转染该基因后，前体药物丙氧鸟苷（GCV）或无环鸟苷（ACV）会变得敏感，从而导致肿瘤细胞死亡［3］。2019年1月—11月，本研究采用前期课题组制备的胍基化SS-PAAs类阳离子聚合物（AGMCBA）作为HSV-TK自杀基因的核定位载体［4-5］，再利用人上皮生长因子受体2（HER2）靶向纳米超声造影剂包裹作为基因的靶向载体，研究该纳米超声造影剂的理化特性和体外超声显影效果。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、生物素化二硬酯酰磷脂酰乙醇胺（Biotin-DSPE-PEG2000）购自美国Avanti公司；胆固醇（天津市光复精细化工研究所）；全氟己烷（PFH，Shangfluoro公司）；链霉亲和素（美国Bioss公司）；HSV-TK（上海生工生物工程有限公司）；抗HER2抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）-抗HER2抗体（上海亿欣生物科技有限公司）；Hochest33342、Cy5荧光染料（碧云天生物技术有限公司）；NCI-N87胃癌细胞株（中国科学院细胞库）；PBS缓冲液（Solarbio公司）。旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；酶标仪（Thermo Fisher公司，美国）；湘仪H-1650高速离心机；脂质体挤出器（LiposoFast，Avestin公司）；低功率聚焦超声仪（重庆融海超声医学工程研究中心）；激光粒度仪及电位仪（英国马尔文仪器有限公司）；SN3400扫描电子显微镜；激光共聚焦显微镜（德国）；电子天平（Sartorius公司）；恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；FACSAria流式细胞仪；KH5200DB型数控超声波清洗器；超声波诊断仪（PhilipsIU22）。

1.2 AGM-CBA／HSV-TK载体基因复合物的制备 AGM-CBA由前期课题组合成［4］。制备一定浓度AGM-CBA的PBS溶液，记为溶液A；另制备一定浓度HSV-TK质粒的PBS溶液，记为溶液B。随后分别将等体积不同浓度溶液A小心加入等体积溶液B中，轻轻混匀，37℃孵箱中孵育30 min制备得到载体/基因复合物。并取上述少许复合物溶液采用马尔文激光粒度仪检测其粒径。

1.3 载HSV-TK基因及PFH的纳米超声造影剂的制备以及基因在造影剂中包封率的测定 ①将制好的载体基因复合物放到4℃冰箱备用。②称取8.8 mg DPPC、3.0 mg胆固醇、2.8 mg Biotin-DSPEPEG2000（DPPC∶胆固醇∶Biotin-DSPE-PEG2000的摩尔比为60∶40∶5），加无水乙醇2 mL，37℃水浴，搅拌使其溶解（溶解过程中用锡箔纸封住瓶口，防止蒸发）。将其置于旋转蒸发仪，以37℃旋蒸30 min，使磷脂/胆固醇的乙醇液在壁上成膜，减压除乙醇，氮气吹干30 min，制备脂质膜。另取PBS缓冲液2 mL，置于小烧杯内，37℃水浴中保温，待用。将制备好的载体基因复合物加入上述PBS缓冲液中，再将包含载体基因复合物的PBS缓冲液加入制备好的脂质膜中，转动下37℃水化30 min，即制得包载载体基因复合物的脂质体。③取上一步骤中的脂质体混悬液0.75 mL转移至2 mL EP管内，向EP管内逐滴加入40μL PFH。在全程冰浴条件下，采用超声波清洗器对EP管内混合液进行震荡，频率为80 Hz，时间设为16 min。④将混合液装入离心管，转速12 000 r/min，离心2 min，去上清于聚乙烯管备用，然后向离心管加入PBS缓冲液，用漩涡振荡器混匀，重复3次，以去除未结合的脂质及PFH，最后得到乳白色的脂质包裹载体基因复合物及PFH的造影剂。⑤将做成的脂质体依次通过夹有1μm及400 nm的聚碳酸酯膜的挤出器，分别挤出21次，最终制得载有HSV-TK基因及PFH的纳米超声造影剂。⑥将造影剂置于4℃冰箱内保存备用。⑦上清液中含有未包裹于造影剂的载体/基因复合物，向装有上清液的聚乙烯管中加入等体积的肝素钠，37℃孵育30 min，即将复合物中的HSV-TK替换为肝素。采用酶标仪测量复合物的荧光强度，设置激发波长为510 nm、发射波长为595 nm。通过HSV-TK溶液的标准曲线计算游离基因的含量。造影剂对基因的包封率的计算公式［6］为包封率（%）=（投入量-游离量）/游离量×100%。

1.4 HER2靶向纳米超声造影剂的制备 取上述纳米超声造影剂100μL加入900μL的PBS溶液中稀释；然后加入链霉亲和素30μL（5 mg/mL），间断轻微摇晃并将其置于4℃下静置30 min后离心（12 000 r/min，2 min），去除上清液，PBS缓冲液洗涤3次，加入生物素化HER2抗体25μL（1μg/mL），轻轻摇匀后继续放置于4℃冰箱中避光反应30 min；反应后取出混合液离心（12 000 r/min，2 min），去除上清，PBS缓冲液洗涤3遍，即制得HER2靶向纳米超声造影剂。

1.5 靶向纳米超声造影剂的基本特性鉴定及形态学观察 取上述少许造影剂溶液置于扫描电子显微镜，观察其形态及均一性；另取少许造影剂溶液，采用马尔文激光粒度仪检测造影剂粒径及电位。

1.6 HER2抗体与造影剂的连接情况检测 取9μL的异硫氰酸荧光素—抗HER2抗体分别缓慢滴加于按上述方法制备好的非靶向超声造影剂和HER2靶向超声造影剂中，采用流式细胞仪分别对造影剂与HER2抗体连接前后进行定量检测。

1.7 靶向纳米超声造影剂的核定位效应实验 HSVTK先用Cy5荧光染料标记（Label IT®核酸标记技术），再制备HER2靶向纳米超声造影剂。将课题组之前培养的NCI-N87胃癌细胞以2×105细胞/皿的密度接种在培养皿的盖玻片上培养过夜。转染研究前，将培养基更换为新鲜的无血清培养基。然后将100μL载有AGM-CBA／HSV-TK的靶向纳米超声造影剂的复合物添加到每个孔中，随之用低频超声辐照。低频超声照射条件根据前期课题组优化后设置为650 kHz，1.5 W/cm2，照射时间60 s。将NCIN87细胞在37℃下培养4 h，并用PBS洗涤细胞3次。将8μg/mL的Hoechst 33342孵育以染色细胞核，然后用4%多聚甲醛（1.5 mL/皿）固定30 min，最后使用激光共聚焦显微镜来分析该造影剂的核定位作用。

1.8 体外显影实验 以制备的靶向纳米超声造影剂为实验组，以超纯水为对照组，以巴氏滴管作为体外模型。将实验组和对照组样品吸入滴管中，使用PhilipsIU22彩色超声诊断仪，采用造影模式（L9-3/Cont Gen），热指数（TIS）为0，机械指数（MI）为0.13进行超声造影成像。

2 结果

2.1 AGM-CBA/HSV-TK载体基因复合物的粒径 马尔文激光粒度仪显示，AGM-CBA/HSV-TK载体基因复合物的粒径为（96.73±1.27）nm。

2.2 HSV-TK基因在超声造影剂中的包封率 HSV-TK基因在超声造影剂中的包封率约为63%。

2.3 靶向纳米超声造影剂的形态特征 在宏观状态下，超声造影剂溶液呈乳白色，不透明，静置一段时间后没有明显的分层现象；扫描电子显微镜下观察发现，造影剂呈球形，表面较光滑，大小均一，形态规则；马尔文激光粒度仪显示粒径为（550.93±10.19）nm，Zeta电位为（-9.75±0.74）mV。

2.4 HER2抗体与造影剂的连接情况 非靶向超声造影剂荧光抗体结合率为0.04%，靶向超声造影剂荧光抗体结合率为50.24%，抗体与脂质体成功连接。

2.5 靶向纳米超声造影剂的核定位效应 经过4 h的转染，大部分细胞均能观察到红色荧光，表明HSV-TK成功递送至细胞中。

2.6 体外显影效果 超声造影成像结果显示，靶向纳米超声造影剂回声明显增强，并表现为细腻均匀的点状密集高回声；超纯水则为无回声。

3 讨论

分子影像学的出现是医学影像学发展的一个里程碑，超声造影剂作为分子成像的一个重要组成部分，在临床试验中得到了广泛的应用，扩展了传统成像模式的诊断能力和实用价值。与微米尺寸的超声造影剂相比，纳米级别的造影剂更适合于靶向分子成像，且其尺寸更小，更可能作为治疗手段，已成为近年来的研究热点［7-8］。纳米级超声造影剂中，脂质体外壳包裹氟碳化合物形成的纳米泡成像效果最好。DPPC及DSPE是两种合成磷脂，是许多细胞膜的主要磷脂成分，具有良好的生物相容性，胆固醇具有调节膜流动性的作用。故本研究采用薄膜水化机械振荡法，以合成磷脂（DPPC、DSPE）、胆固醇为成膜材料制备脂质体超声造影剂。扫描电镜下见造影剂纳泡呈球形，形态规则，动态光散射测定粒径为（550.93±10.19）nm，其能穿透肿瘤血管内皮间隙，使在血管外超声分子成像成为可能。

本研究以前期课题组构建的聚合物AGM-CBA作为HSV-TK的核定位载体，该聚合物具备将不同质粒DNA压缩为纳米级基因/载体复合物的能力，能够对质粒DNA实现稳定包载，保护其不被核酸酶降解；形成的载体基因复合物主要通过网格蛋白和小窝蛋白介导的途径入胞，同时入胞后被包载的质粒DNA有很好的释放效率。既往研究结果表明，其细胞毒性更低，转染效率更高，表现出优良的核定位效应［9-10］，具有良好的应用前景。

超声造影剂接靶方法有多种，如共价偶联法、吸附法等。其中，“生物素—亲和素桥接法”是目前应用最为广泛的接靶方法。该方法不仅操作简便、接靶效率高，而且连接牢固。生物素与亲和素之间以非共价键结合，所以也是目前已知最强的一种结合粘连系统［11-12］。链霉亲和素是一种类似于亲和素的蛋白质，它有四个亚基能够与生物素连接，每个亚基可以结合一个生物素分子，因而其亲和力高于亲和素，且价格低廉。本研究应用该方法，以在许多肿瘤中都有过表达抗原HER2为靶点，利用链霉亲和素将生物素化HER2抗体和Biotin-DSPE-PEG2000非共价键结合，成功制备出HER2靶向超声造影剂，流式细胞仪检测其连接率较理想。但与传统超声造影剂相比，靶向纳米超声造影剂是否有更好的稳定性仍需进一步研究。

自杀基因疗法是一种非常具有前景的肿瘤治疗方法，自杀基因进入肿瘤细胞，并在合适的底物存在下诱导肿瘤细胞凋亡。除了诱导细胞凋亡外，参与这一过程的另一种机制是旁观者效应，即转染细胞产生的有毒代谢物被转移到邻近细胞，导致细胞死亡。HSV-TK/GCV系统是目前最常用的自杀基因治疗系统之一，HSV-TK自杀基因的表达可导致胸苷激酶的产生，这种酶可将GCV单磷酸化，细胞激酶将无毒的单磷酸化GCV转化为有毒的GCV三磷酸，即脱氧鸟苷三磷酸类似物，它可以抑制DNA聚合酶并破坏DNA合成［13-15］。故本研究通过构建一种携带HSV-TK自杀基因的脂质超声造影剂，以期成为传递抗肿瘤基因的有效载体，自杀基因的杀伤肿瘤细胞的效果将在后续的细胞实验中进一步考察。

液态氟碳类造影剂在体内显像方面存在更多优势，如更低的毒理学危险度、更长的组织内循环时间及可更加持久的抵抗外界压力和机械应力的变化［16］。PFH作为一种安全无毒的液体，具有相转变特性。有研究表明将PFH包裹在纳米粒中，利用其相转变特性瞬间释放能量，可杀伤肿瘤［17-18］。并且，气化后的PFH可形成微米级气泡，仍具备增强回声信号的能力。故本研究采用PFH作为脂质体超声造影剂的显像内核，并且体外显影效果理想。

综上所述，本研究制备了一种以HER2为靶点同时载有HSV-TK基因且具有核定位效应的纳米超声造影剂，其大小分布均匀，形态规则，且有良好的体外超声显影效果。本实验为后续的体外细胞实验和体内动物实验奠定了一定基础。