重组人腺病毒P53和碘125粒子调节Bax和Bcl2对裸鼠胆管癌移植瘤增殖和凋亡的影响

和庆章 王桂良 邱 萍 徐林芳 龚敏 付云辉 韩明 文剑波

[關键词] 胆管癌;rHAd-P53;碘125;Bcl2;Bax

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）29-0044-05

Impacts of recombinant human adenovirus P53 and iodine-125 particles regulating Bax and Bcl2 on proliferation and apoptosis of transplanted tumor of cholangiocarcinoma in nude mice

HE Qingzhang   WANG Guiliang   QIU Ping   XU Linfang   GONG Min   FU Yunhui   HAN Ming   WEN Jianbo

Department of Gastroenterology， Pingxiang Hospital Affiliated to Gannan Medical University， Pingxiang   337000， China

[Abstract] Objective To explore the impacts of recombinant human adenovirus P53（rHAd-P53） and iodine-125 particles regulating Bax and Bcl2 on proliferation and apoptosis of transplanted tumor of cholangiocarcinoma in nude mice. Methods Human cholangiocarcinoma cells were selected to establish human cholangiocarcinoma xenograft model in nude mice. A total of 48 nude mice were divided into the blank control group， the rHAd-P53 group， the iodine-125 particles group and the rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group. The transplanted tumor size and weight were measured before and after treatment，the proliferation-related protein （Ki-67） was detected by immunohistochemistry， the apoptosis index was detected by TUNEL method， the expression of Bcl2 and Bax mRNA was detected by Realtime-PCR method， and the expression of Bcl2 and Bax protein was detected by Western blot method. Results After treatment， compared with the blank control group， the volume difference， tumor weight， proliferation index， Bcl2 and Bcl2/Bax mRNA， Bcl2 protein of transplanted tumor in the rHAd-P53 group， the iodine-125 particles group and the rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were significantly decreased， while Bax mRNA and protein were significantly increased.Compared with the rHAd-P53 group， the volume difference， tumor weight， proliferation index，significance of Bcl-2 and Bcl-2/Bax mRNA， Bcl-2 protein of transplanted tumor in the iodine-125 particles group or rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were all significantly decreased， while the tumor inhibition rate， Bax mRNA and protein were all significantly increased.Compared with the iodine-125 particles group， the volume difference， tumor weight， proliferation index， Bcl-2 and Bcl-2/Bax mRNA and Bcl-2 protein of transplanted tumor in rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were all significantly decreased， while the tumor inhibition rate， Bax mRNA and protein were all significantly increased. Conclusion RHAd-P53 and iodine-125 particles can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of transplanted cholangiocarcinoma in nude mice by inhibiting the expression of Bcl2 and promoting the expression of Bax. rHAd-P53 can enhance the sensitivity of iodine-125 particles radiotherapy， and the effect of combining them is better than that of using them singly.

[Key words] Cholangiocarcinoma; rHAd-P53; iodine-125; Bcl2; Bax

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其位置特殊、发病隐匿、恶性程度高、手术切除机会小、体外放疗和化疗效果均不理想[1]，碘125粒子局部放療具有创伤低、靶向效果好、并发症少、对正常组织损害小等优点，因而越来越受到国内外学者的重视[2]。P53基因是最有效的抑癌基因，能有效调节细胞周期、诱导肿瘤细胞死亡。rHAd-P53能增强肿瘤对碘125粒子放疗的敏感性[3]，现已广泛应用于临床，国内外尚没有将二者联用的研究报道，本研究应用rHAd-P53和碘125粒子单独治疗及联合治疗人裸鼠胆管癌移植瘤模型，以观察rHAd-P53对碘125粒子治疗胆管癌敏感性的影响，为基础研究及临床应用提供新的思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

BALB/c-nu裸鼠（5～6周龄，体重18～22 g，SPF环境下饲养），购自江西中医学院动物部[动物许可证号：SYXK（赣）2008-0006）];人胆管癌细胞株QBC939细胞株购自美国ATCC公司;重组人rHAd-P53（1×1012VP/支，国药准字S20040004）购自深圳赛百诺公司;Bax、Bcl2、GAPDH一抗购自美国Abcam公司;碘125粒子（粒子活度为0.6 mCi）购自北京智博高科生物技术有限公司;cDNA合成试剂盒购自美国Thermo公司;TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司;Trizol试剂自美国Invitrogen公司;PCR反转录试剂盒和Taq聚合酶购自日本TaKaRa公司。Real time PCR扩增基因引物序列见表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠胆管癌模型制备及分组  将QBC939细胞株（1×106个）接种于裸鼠右腋窝皮下。接种后观察肿瘤生长情况，肿瘤直径约0.5 cm时即用于实验。根据治疗方案将裸鼠随机分为四组：空白对照组;rHAd-P53组;碘125粒子组;rHAd-P53+碘125粒子组，每组各12只。

1.2.2 空白对照  给裸鼠每日一次瘤内注射生理盐水0.1 mL，共6次。

1.2.3 rHAd-P53治疗  给裸鼠每日一次瘤内注射rHAd-P53 1×1010 VP，共6次。

1.2.4 碘125粒子治疗  用穿刺针将1颗碘125粒子置入瘤体中央。

1.2.5 肿瘤体积计算  治疗前及每次治疗时测量肿瘤体积（=0.5×长径×短径2），抑瘤率（IR）=（空白对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/空白对照组平均瘤重×100%。

1.2.6 细胞增殖和凋亡情况观察  将裸鼠移植瘤的冰冻组织切片行常规HE染色，观察组织显微形态，通过免疫荧光检测腺病毒载体上的绿色荧光蛋白（EGFP）标签，显示rHAd-P53在组织细胞内的表达水平。采用免疫组化法检测Ki-67蛋白的表达，反映肿瘤细胞增殖情况，每张切片随机选取5个高倍视野（400×），分别计数阳性细胞数及肿瘤细胞总数。增殖指数（PI）%=阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%;TUNEL法检测细胞凋亡，凋亡指数（AI）%=[凋亡细胞数/肿瘤细胞总数]×100%[3]。

1.2.7 Real-time PCP检测Bcl2和Bax mRNA的表达  以β-actin作为内参照，配制20 μL的反应体系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，SYBR Enzyme 10 μL，cDNA 1 μL，无酶水8 μL。反应条件为： 95℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃延伸1 min，40个循环。计算Bcl2和Bax mRNA的相对表达量。

1.2.8 Western blotting检测Bcl2和Bax蛋白的表达  提取组织总蛋白，以10% SDS-聚丙烯酰胺胶电泳，后转至PVDF膜上，以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜;TBST洗膜3次，每次10 min，加入荧光二抗，室温避光孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;加入显色液后，ECL显色，利用Image J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白与内对照GAPDH条带的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，正态分布且方差齐的计量资料多组间比较采用单因素方差分析，偏态分布或正态分布但方差不齐的计量资料多组间比较采用非参数检验，组间两两比较采用LSD法。计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组移植瘤显微形态变化

免疫荧光显示，空白对照组没有EGFP表达，rHAd-P53组有EGFP表达，且表达较高，说明rHAd-P53转染效率较高。HE染色显示，空白对照组瘤细胞排列密集，大小不等，细胞核较大，可见病理性核分裂象，血管较为密集，血供丰富;rHAd-P53组和碘125粒子组可见坏死肿瘤细胞，肿瘤细胞间隙较大，部分癌细胞呈活跃状，细胞间隙略大;rHAd-P53组+碘125粒子组可见大片坏死的肿瘤细胞及核固缩、核碎裂的细胞，细胞间隙较大。见封三图4。

2.2 裸鼠移植瘤治疗后生长状况比较

给予重组rHAd-P53注射后，利用绿色免疫荧光检测显示，P53在移植瘤组织高表达。与空白对照组比较，rHAd-P53组、碘125粒子组、rHAd-P53+碘125粒子组瘤重显著性降低。与rHAd-P53组比较，碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组瘤重显著性降低，抑瘤率显著性增加。与碘125粒子组比较，rHAd-P53+碘125粒子组瘤重显著性降低，抑瘤率显著性增加。见表2。

2.3 四组裸鼠治疗后增殖与凋亡情况比较

与空白对照组比较，rHAd-P53组、碘125粒子组、rHAd-P53+碘125粒子组增殖指数显著性降低，凋亡增殖指数显著性增加。与rHAd-P53组比较，碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组增殖指数显著性降低，凋亡增殖指数显著性增加。與碘125粒子组比较，rHAd-P53+碘125粒子组增殖指数显著性降低，凋亡增殖指数显著性增加。见表3。

2.4 四组裸鼠治疗后Bcl2和Bax mRNA表达量比较

与空白对照组比较，rHAd-P53组、碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA显著性降低，Bax mRNA显著性增加。与rHAd-P53组比较，碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA显著性降低，Bax mRNA显著性增加。与碘125粒子组比较，rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA显著性降低，Bax mRNA显著性增加。见表4。

2.5 四组治疗后Bcl2和Bax蛋白表达量比较

与空白对照组比较，rHAd-P53组、碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2蛋白显著性降低，Bax蛋白显著性增加。与rHAd-P53组比较，碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2蛋白显著性降低，Bax蛋白显著性增加。与碘125粒子组比较，rHAd-P53+碘125粒子组Bcl2蛋白显著性降低，Bax蛋白显著性增加。见图1。

3 讨论

胆管癌由胆道上皮细胞的恶变而来，发病机制与炎症和胆汁淤积导致胆管细胞DNA损伤﹑碱基错配﹑原癌基因的激活及抑癌基因的失活、细胞因子和生长因子表达异常、异常细胞增殖相关[4-5]。从细胞凋亡角度研究肿瘤的发生和治疗是目前研究的热点。P53是一种抑癌基因，不但自身具有抗肿瘤作用，且能提高对肿瘤细胞的放疗敏性[6]。Bcl2和Bax是细胞凋亡中的两个关键因子，Bcl2是一种重要的抗凋亡基因，能促进细胞存活、抑制细胞凋亡[7]，Bax是一种重要的促凋亡基因，可形成同源二聚体或与Bcl2形成异源二聚体，阻遏Bcl2发挥作用[8]。Bax/Bcl2两蛋白之间的比例关系决定对细胞凋亡抑制作用强弱，Bcl2/Bax比值上调，抑制细胞凋亡，Bcl2/Bax比值下调，促进细胞凋亡[9]。靶向抑制Bcl2和（或）促进Bax的表达有助于杀灭肿瘤细胞。

由于胆管癌发病位置隐匿、早期症状不明显、影像学技术对较小胆管癌的诊断率低，患者就诊时多为中晚期，手术治愈率低，因为化疗和体外放疗的副作用大，在临床受到一定程度的限制[10]。rHAd-P53能将P53基因导入肿瘤细胞，表达P53蛋白，从而发挥抑制细胞分裂、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，刺激机体的特异性抗肿瘤免疫反应，上调多种抗癌基因和下调多种癌基因的活性，并有抑制血管内皮生长因子基因和药物多抗性基因表达的作用，正被作为新的治疗方案得到推广。国内外部分学者研究了碘125对某些肿瘤的疗效，Li等[11]应用rHAd-P53转染胰腺癌SW1990细胞发现，rHAd-P53胰腺癌细胞对辐射敏感性增加。Xu等[12]发现rHAd-P53联合放疗治疗头颈部淋巴瘤，T细胞亚群（CD3/CD4/CD8）增加，白细胞介素2受体水平降低，疗效提高。碘125粒子的作用机制为近距离持续向肿瘤组织释放γ射线破坏肿瘤细胞细胞膜、破坏DNA双链结构，从而杀灭或抑制肿瘤细胞生长[13]。2015年Wang等[14]应用125I粒子照射胰腺癌细胞株SW1990和PANC-1细胞，发现125I粒子能诱导癌细胞凋亡和G2/M细胞周期停滞而起到杀伤作用，2016年Li等[15]应用125I粒子植入治疗胰腺癌患者可使肿瘤缓解率增加，2018年Hu等[16]应用超声引导125I粒子植入治疗胰腺癌患者，能提高患者缓解率、生存率和中位生存期。但是肿瘤在接受放疗的过程中，自身会产生放疗抵抗，参与放疗抵抗的相关分子有Survivin、nm23-H1、CyclinD1、HSF1、HSP70、HSP90等，联用rHAd-P53可抑制放疗抵抗，增强肿瘤组织放疗的敏感性[17]。但P53抑制肿瘤细胞生长及增加放疗敏感性的具体机制尚需进一步研究。

本实验以胆管癌细胞株接种到裸鼠皮下建立胆管癌移植瘤模型，观察rHAd-P53、碘125粒子和rHAd-P53+碘125粒子治疗胆管癌的疗效，结果发现，与空白对照组比较，rHAd-P53组、碘125粒子组和rHAd-P53+碘125粒子组移植瘤体积差值、瘤重、增殖指数、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均显著性降低，Bax mRNA和蛋白均显著性升高。与rHAd-P53组比较，碘125粒子组、rHAd-P53+碘125粒子组rHAd-P53组或碘125粒子组或rHAd-P53+碘125粒子组移植瘤体积差值、瘤重、增殖指数、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均显著性降低，抑瘤率、Bax mRNA和蛋白均显著性升高。与碘125粒子组比较，rHAd-P53+碘125粒子组移植瘤体积差值、瘤重、增殖指数、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均显著性降低，抑瘤率、Bax mRNA和蛋白均显著性升高。以上结果说明，rHAd-P53和碘125粒子均能抑制肿瘤生长，碘125粒子的效果优于rHAd-P53，rHAd-P53和碘125粒子联用后较单用效果增加，说明rHAd-P53能增强碘125粒子放疗的敏感性。由于肿瘤细胞增殖和凋亡是由一系列相关基因的作用所致，为了进一步探讨rHAd-P53和碘125粒子治疗胆管癌裸鼠抑植瘤的机制，本研究选择了2个典型的凋亡相关基因（Bcl2和Bax）进行研究，结果发现，与空白对照组比较，rHAd-P53和碘125粒子均能促进Bax mRNA和蛋白的表达，抑制Bcl2mRNA和蛋白的表达，碘125粒子的作用优于rHAd-P53，二者联用后效果优于任何一种单用方案的效果。P53作为一种转录因子，可能通过与Bax和Bcl2基因的启动子直接结合或与其他转录因子相互作用与启动子间接结合从转录水平调节其表达进一步导致细胞凋亡。碘125可调节某些转录因子、lincRNA或micro RNA的表达间接调控Bax和Bcl2基因的表达导致细胞凋亡，P53与碘125联用后，调节Bax和Bcl2基因表达的作用增强，因此放疗敏感性增加。由于胆管癌的发病机制、各种治疗措施产生的疗效机制非常复杂，P53和碘125对Bax和Bcl2的具体调控机制及其对其他凋亡相关基因的表达而影响胆管癌增殖和凋亡的机制尚需以后的实验进一步研究。

综上所述，rHAd-P53和碘125粒子能通过抑制促凋亡基因Bcl2的表达、促进促凋亡基因Bax的表达而抑制裸鼠胆管癌移植瘤增殖、促进其凋亡，碘125粒子的效果优于rHAd-P53，rHAd-P53与碘125粒子联用后，放疗的敏感性增加，效果增强。

[参考文献]

[1] Khan AS，Dageforde LA.Cholangiocarcinoma[J].Surg Clin North Am，2019，99（2）：315-335.

[2] Wang H，Wang J，Jiang Y. The investigation of 125I seed implantation as a salvage modality for unresectable pancreatic carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2013，32（1）：106.

[3] Wachter F，Grunert M，Blaj C. Impact of the P53 status of tumor cells on extrinsic and intrinsic apoptosis signaling[J].Cell Commun Signal，2013，11（1）： 27-32.

[4] 赵明恩，阳丹才让.胆管癌发病机制研究及诊疗进展[J].临床医药文献电子杂志，2018，70（5）：197.

[5] Labib PL，Goodchild G，Pereira SP.Molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma[J]. BMC Cancer，2019，19（1）：185.

[6] Lee CL，Blum JM，Kirsch DG. Role of P53 in regulating tissue response to radiation by mechanisms independent of apoptosis[J]. Transl Cancer Res，2013，2（5）：412-421.

[7] Jian X，Qu L，Wang Y，et al. Trichostatin A-induced miR-30a-5p regulates apoptosis and proliferation of keloid fibroblasts via targeting BCL2[J].Mol Med Rep，2019，19（6）：5251-5262.

[8] Yuan Y，Wang YY，Liu X，et al. KPC1 alleviates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in rat cardiomyocyte cells though BAX degradation[J].J Cell Physiol，2019， 234（12）：22 921-22 934.

[9] Karimi Ardestani S，Tafvizi F，Tajabadi Ebrahimi M. Heat-killed probiotic bacteria induce apoptosis of HT-29 human colon adenocarcinoma cell line via the regulation of Bax/Bcl2 and caspases pathway[J].Hum Exp Toxicol，2019，38（9）：1069-1081.

[10] 奚松陽，房栋，霍介格.肝内胆管癌的分子靶向治疗进展[J].世界华人消化杂志，2018，26（29）：1707-1716.

[11] Li J，Pan J，Zhu X，et al. Recombinant adenovirus-P53 （Gendicine） sensitizes a pancreatic carcinoma cell line to radiation[J].Chin J Cancer Res，2013，25（6）：715-721.

[12] Xu YH，Liu SH，Han FR，et al. Recombinant recombinant human adenovirus P53 combined with radiotherapy improves efficacy and safety in the treatment of head and neck lymphoma[J].Cancer Biomark，2018，23（2）：213-220.

[13] Nag S，DeHaan M，Scruggs G，et al. Long-term follow-up of patients of intrahepatic malignancies treated with iodine-125 brachytherapy[J].J Radiat Oncol Biol Phys，2006， 64（3）：736-744.

[14] Wang ZM，Lu J，Zhang LY，et al. Biological effects of low-dose-rate irradiation of pancreatic carcinoma cells in vitro using 125I seeds[J]. World J Gastroenterol，2015， 21（8）：2336-2342.

[15] Li YF，Liu ZQ，Zhang YS，et al. Implantation of radioactive （125）I seeds improves the prognosis of locally advanc-ed pancreatic cancer patients：A retrospective study[J]. J Hua-zhong Univ Sci Technolog Med Sci，2016，36（2）：205-210.

[16] Hu Y，Qi E，Liu F，et al. The application of a three-dimensional visualized seed planning and navigation system in （125）I seed implantation for pancreatic cancer[J]. Onco Targets Ther，2018，11：619-627.

[17] Jiang X，Li L，Li Y，et al.Molecular mechanisms and countermeasures of immunotherapy resistance in malignant tumor[J].J Cancer，2019，10（7）： 1764-1771.

（收稿日期：2020-10-12）