正交试验优化桑叶中蛋白提取工艺

刘苗苗，史 锐，吴 鹏，丛龙娇

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 沈阳 110000)

桑叶为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶，味甘、苦，性寒，归肝、肺经。《中国药典》记载桑叶药材具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，主要用于治疗风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花等[1]，中医称之为“铁扇子”，是常用的中药材。桑叶中化学成分复杂，主要含有N-糖化合物、芸香苷、槲皮素、挥发油、蛋白质、维生素及微量元素等多种活性成分，具有降血糖、降血脂、降血压、抗菌和抗病毒等药理活性[2-4]。桑叶中蛋白含量较高，其干物质中含有粗蛋白约29.83%[5]。随着植物蛋白的药用价值的逐步被植物蛋白发现，人们将更多的目光放在植物蛋白的深入研究上。因此对其的提取工艺进行优化具有重要的学术意义和应用价值。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

药材：桑叶于2019年7月采自于辽宁本溪的一棵野生桑树，经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为桑科植物桑(MorusalbaL.)的叶，采摘后的桑叶洗净晒干后粉碎备用。

试剂：考马斯 G-250(上海源叶生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(上海源叶生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱；FW100高速万能粉碎机；UV5100紫外可见-分光光度计；KQ5200DB型数控超声波清洗器。

2 方法

2.1 桑叶蛋白质含量测定方法

2.1.1 标准品蛋白溶液制备 取牛血清白蛋白50 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀，即得浓度为0.502 mg·mL-1的蛋白质标准溶液。

2.1.2 线性关系考察 按文献[6]方法配制考马斯亮蓝G-250溶液。分别精密吸取标准品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，分别加水定容至2 mL，摇匀；再分别加入考马斯亮蓝G-250溶液10 mL，振荡，放置10 min。取空白溶液组进行基准校正后，于595 nm下测定吸光度(A)。以标准品质量浓度(mg/mL)为X轴，吸光度(A)为纵坐标Y轴绘制标准曲线，并求出线性回归方程。

2.2 桑叶蛋白提取工艺的优化研究

2.2.1 桑叶蛋白提取方法 先将桑叶洗净除去杂质，用55 ℃烘箱烘干，干燥后用粉碎机粉碎，粉末过3号筛，按照一定料液比加入一定质量分数的NaCl提取溶剂，超声波处理后用水浴锅浸提，离心后取上清液，得到桑叶蛋白质溶液。

2.2.2 单因素考察 (1)NaCl质量分数对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数分别为0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的NaCl溶液为提取溶剂，按照1∶20的料液比在超声功率为100 W，超声温度为40 ℃的条件下超声处理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

(2)料液比对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数为0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，分别按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的料液比加入提取溶剂，在超声功率为100 W、超声温度为40 ℃的条件下超声处理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

(3)超声温度对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数为0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，在超声功率固定为100 W，超声温度分别为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃的条件下超声处理20 min，40 ℃水浴浸提60 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

(4)超声时间对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数为0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，在超声功率为100 W，超声温度为40 ℃的条件下分别超声处理10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，40 ℃水浴浸提60 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

(5)浸提温度对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数为0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，在超声功率为100 W，超声温度为40 ℃的条件下超声处理20 min，分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的温度下水浴浸提60 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

(6)浸提时间对桑叶蛋白提取率的影响：精密称取0.5 g桑叶粉，以质量分数为0.4%的NaCl溶液为提取溶剂，料液比为1∶30，在超声功率为100 W，超声温度为40 ℃的条件下超声处理20 min，在40 ℃水浴中分别浸提30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min，离心后取上清液，采用考马斯亮蓝方法测出A值，计算桑叶蛋白的提取率。

2.2.3 正交试验 根据单因素试验的考察结果，NaCl质量分数(A)、料液比(B)、超声时间(C)、浸提时间(D)4个因素对蛋白提取率具有显著性影响。为了进一步研究4个因素对提取率的影响，优选桑叶蛋白提取工艺，每个因素选取3个水平，采用L9(34)安排试验，具体因素水平见表1。

表1 桑叶蛋白L9(34)因素水平提取工艺

2.3 桑叶样品蛋白质含量的计算

按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，得到不同提取方法所制备的桑叶蛋白溶液，从中取0.5 mL溶液，其余按照“2.1.2”项下条件操作，取空白溶液组进行基准校正后，于595 nm下测定吸光度。

2.4 桑叶蛋白提取率计算

根据每次实验测得的吸光度A求出蛋白质浓度C(mg/mL)，桑叶蛋白提取率=(C×V/m)×100%，其中V为桑叶蛋白溶液的体积，m为提取所用桑叶样品质量(g)。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

标准曲线如图1所示，以蛋白质浓度(mg/mL)为X轴，吸光度(A)为Y轴绘制标准曲线，得到y=2.161 4x+0.060 8(R2=0.993 6)。结果表明牛血清白蛋白在0.050 2～0.502 0 mg/mL浓度范围内与吸光度值线性关系良好。

图1 牛血清白蛋白曲线

3.2 桑叶蛋白提取单因素试验结果分析

3.2.1 不同提取溶剂浓度对桑叶蛋白提取的影响 研究发现，大部分蛋白质都可以溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，而通过对植物叶蛋白提取进行考察发现，NaCl溶液是提取植物叶蛋白最常用的浸提剂，其盐溶作用可以促进蛋白的水解，同时稀盐溶液中的盐离子与蛋白质结合可以保护蛋白质不变性[7]。图2显示，NaCl的质量分数为0.4%时，吸光度A值达到最高，为0.637。当NaCl溶液浓度进一步增加时，吸光度反而下降，原因可能是随着盐浓度的增加，核酸提取的量也增大，给桑叶蛋白的提取纯化带来困难[8]。故0.4% NaCl溶液为最适合提取桑叶蛋白的溶剂。

图2 提取溶剂浓度对桑叶蛋白提取的影响

3.2.2 不同料液比对桑叶蛋白提取的影响 料液比是提取工艺中常考虑的因素之一，在提取中不同料液比会影响溶液的黏度和浓度。料液比较小时，溶液黏度大，蛋白质分子不易扩散，提取率小；而料液比偏大时，由于浓度差变小，蛋白质的提取反而更加困难，因此通过实验确定桑叶蛋白质提取的最适料液比十分重要。实验结果如图3，当料液比为1∶30时，吸光度值最高，达到0.743，因此选择料液比为1∶30作为桑叶蛋白提取的最适条件。

图3 料液比对桑叶蛋白提取的影响

3.2.3 不同超声温度对桑叶蛋白提取的影响 在关于蛋白质的提取研究中，温度一直是需要考虑的重要因素，本实验对提取时超声的温度进行考察，结果如图4。吸光度随着温度升高而增加，在40 ℃时达到最高值，为0.642，最后趋近于平稳，相较于其他因素，超声温度对桑叶蛋白提取率无显著影响，故设定超声温度40 ℃为提取桑叶蛋白的最适条件。

图4 不同超声温度对桑叶蛋白提取的影响

3.2.4 不同超声时间对桑叶蛋白提取的影响 本次实验中，超声的功率设定为100 W不变，对超声时间进行考察。由图5可知，在超声30 min后吸光度值达到最高，为0.856，随后逐渐下降，因此选择超声30 min作为提取桑叶蛋白的最适条件。

图5 不同超声时间对桑叶蛋白提取的影响

3.2.5 不同浸提温度对桑叶蛋白提取的影响 除了超声温度外，本实验还对浸提温度进行了考察。由图6可知，当浸提温度为40 ℃时，吸光度值达到最高，为0.689。升高5 ℃后反而有下降现象，因此将浸提温度设定为40 ℃，是桑叶蛋白提取的最适温度。

图6 不同浸提温度对桑叶蛋白提取的影响

3.2.6 不同浸提时间对桑叶蛋白提取的影响 本实验对不同浸提时间进行考察，结果如图7。由图7可知，随着浸提时间延长，吸光度值有逐渐升高的现象，在60 min时到达最高值，A值为0.723，随后呈逐渐下降趋势，可能是由于浸提时间过长，导致溶液中的蛋白质出现凝聚现象，因此选择浸提时间为60 min作为桑叶蛋白的最适提取条件。

图7 不同浸提时间对桑叶蛋白提取的影响

3.3 正交试验结果分析

按照上述设计的因素水平进行提取测定，结果见表2。表中K值显示，提取最优的组合为A1B3C1D1，即桑叶蛋白提取的最优工艺为NaCl质量分数0.3%，料液比1∶35(g/mL)，超声时间25 min，浸提时间55 min。

3.4 验证性实验

运用上述最优提取方法进行验证性实验，平行测定3次，结果见表3。桑叶蛋白平均提取率为6.05%，RSD为1.29%，与正交表内结果相比，确定此工艺为最优提取工艺，且重复性好，稳定性强，含量高。

4 讨论

本实验确定的桑叶蛋白的最佳提取工艺为NaCl质量分数0.3%，料液比1∶35(g/mL)，超声时间25 min，浸提时间55 min。在此提取工艺下验证3次，得到桑叶蛋白提取率分别为5.94%、6.01%、6.03%，平均提取率为6.01%，RSD为1.29%。相较于以往的研究，正交试验法优化得到的工艺可有效提高桑叶中蛋白质的提取率，为后续该资源的合理应用奠定了基础。

表2 正交试验设计及结果 (n=3)

表3 验证实验结果