血管生成过程中的自噬调控作用及自噬信号通路调控机制研究进展

周罗慧，柏亚明，孙毅，王昱冕，王红

昆明医科大学/昆明医科大学附属心血管病医院（云南省阜外心血管病医院），云南昆明650000

年龄≥50 岁、高脂血症（hyperlipoidemia，HL）、动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）及高血压等均为心血管疾病的影响因素［1］。全世界范围内每年死于心血管疾病的患者高达1 500 万例，且≥50%以上存活患者生活无法自理［2-3］。细胞自噬（Autophagy）在人体的生理、病理过程中随处可见。自噬处于正常表达状态时能起到清理细胞内过量或受损的细胞器和蛋白质，继而维持蛋白质平衡，调节细胞内循环。若机体受到严重损害时，自噬又会参与其中，过度自噬时还会参与疾病进展。当细胞出现过度自噬可参与机体的病理过程。血管损伤后的血管生成和再生对心血管疾病的发生发展具有重要意义。心肌梗死后梗死组织内的血管再生对改善患者心功能极为重要。最新研究，自噬可介导血管生成，但其具体信号通路对血管生成的调控作用机制还需进一步研究。现将血管生成过程中的自噬调控作用及自噬信号通路调控机制研究进展综述如下。

1 自噬的生理功能

自噬广泛存在于真核细胞中，可分为巨自噬、微自噬、分子伴侣介导自噬。细胞在受到刺激时，可诱发自噬，首先细胞内形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自体吞噬泡并在溶酶体内酶解最终完成该过程。自噬在生理条件下可维持细胞稳态，清除功能异常的细胞，保护受损细胞，起到内源性管家的作用；而应激条件下，可导致过度自噬并引起细胞死亡，促进疾病的发生发展。

1.1 自噬的条件及过程 根据细胞内物质运到溶酶体内的途径差异，可将细胞自噬分成三种，即巨自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬（Chaperone mediated autophagy，CMA），巨自噬是最重要的一种。自噬体、自体吞噬泡及溶酶体是自噬发生的必要条件。其中自体吞噬泡是自噬体与溶酶体结合的产物，通常被单层膜包围着，内部常含有尚未分解的内质网、线粒体和高尔基复合体或脂类、糖原等。它的作用底物主要以内源性方式存在，即由细胞内的某些残存（蜕变、破损）的细胞器或（和）局部细胞质构成。当细胞处于正常状态时自体吞噬泡主要扮演“清道夫”的角色，即对细胞内部结构中一些在消化、分解、自然更替的细胞产生作用。研究［4-5］发现，适度增加自体吞噬泡含量对细胞有保护作用。当细胞受到如机械性损伤、射线照射、药物作用等理化伤害时，细胞内自体吞噬泡含量增加。自噬体作为细胞自噬的关键环节，它的半衰期极短，约在8 min左右，由此可判定细胞自噬是细胞对环境变化的一种有效反应，但相关机制目前研究尚未充分。

细胞自噬的过程开始于内质网和高尔基体囊泡将细胞质中的线粒体、内吞体、过氧化物酶体等细胞器包被［6］，并最终形成初始自体吞噬泡（initial autophagic vacuoles，AVi），胞内体与AVi融合后形成中间自体吞噬泡（intermediate autophagic vacuoles，AVi/d），接着溶酶体再与AVi融合，最终形成降解自体吞噬泡（degrading autophagic vacuoles，AVd），AVi中的内容物和内膜被溶酶体内各种酶降解，最终完成细胞自噬［7-8］。细胞自噬过程中始终受到破坏且破坏明显的部位主要是线粒体、内质网。研究［9-10］指出，细胞自噬过程中细胞膜、细胞核并不会受到直接性破坏，但二者最终被消化、分解与其所形成的自体吞噬泡有关。

1.2 自噬的生理功能 细胞自噬作为细胞的一种死亡程序，是细胞主动性死亡的关键因素之一。

细胞自噬具有抑癌、促癌双重性。细胞自噬在肿瘤发生全过程中可保护细胞，同时在早、晚期肿瘤的发展过程中发挥抑癌、促癌作用［11］，造成这一现象的原因主要与细胞自噬的保护对象转移有关。细胞自噬的生理功能可分为以下几点：①内源性管家机制正常状态下的细胞，其运行机制是相对稳定的，在这种情况下的细胞自噬主要发挥管家机制，即过氧化物体、长寿命蛋白、线粒体和内质网进行调控、更新，并在上述基础上对胞内蛋白进行降解和转化细胞器，这是细胞自噬能维持细胞内环境稳定原因所在。②外源性防御和应激调控机制病理学研究［12-13］发现，细胞自噬作为一种防御和应激调控机制，其除了扮演内源性机制外，对外源性刺激也有一定作用，如氧化应激、营养缺乏、感染及低氧等适应性反应均与细胞自噬有关，因为细胞重建、再生、修复等过程中所需的原料由游离脂肪酸、氨基酸等组成，这些物质是由细胞自噬所降解出来的，同时细胞的某些能量循环物质由细胞自噬降解而来，并参与细胞能量供给。③特异性融合细胞自噬还参与组织的特异性融合［14］。细胞自噬可抵御外部环境给细胞造成损伤，参与亚细胞重构，保护受损的细胞。

2 血管生成过程中自噬的调控作用

自噬对血管生成的调控具有双重性，血管损伤后自噬相关蛋白、炎症因子可通过调控细胞自噬促进血管生成。敲除自噬相关蛋白可抑制血管生成。自噬与凋亡也紧密相关，二者均能起到保护心肌细胞的作用，通过促进血管生成，最终实现对细胞的保护。

2.1 自噬促进血管生成 血管生成与细胞自噬关系极为密切，细胞自噬可促进血管生成。研究［15］表明，AS小鼠发生血管损伤时心肌血管损伤处的血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）中的自噬相关蛋白水平的明显下调便伴有miR-214-3p 表达上调现象，自噬相关基因（Autophagy- related genes，ATGs）中的两种蛋白（ATG-5和ATG-12）表达水平与VECs 中的miR-214-3p 呈负相关。同时该研究中的体外试验［16］研究发现，当未成熟的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）自噬受氧化低密度蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）所诱导的群体倍增数（Population Doublings，PDL）的影响时，AS 小鼠的 miR-214-3p 表达相对较低，而当ox-LDL 诱发的自噬发生时，又会受到miR-214-3p 过表达抑制。AS 小鼠机体中不仅有显著的胞质内蛋白微管相关蛋白质1 轻链3BⅡ（LC3BⅡ）蛋白的下调，其胞质内的LC3BⅡ自噬体数目也随之下降。同时有化学抑制剂及特定基因敲除实验证实，心血管疾病患者的一些炎症因子［17］，比如细胞白介素-8（interleukin-8，IL-8）、单核细胞趋化因子-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等所介导的HUVEC 管腔形成均与自噬阻断有关，原因在于自噬阻断后，上述这些炎症因子所诱导的锌指转录因子（Monocyte chemotactic protein -1 induced protein，MCP-1IP）表达便与 IL-8、MCP-1 等产生依赖。在此过程中HUVEC 又会进一步激活氧化应激与自噬，最终促进HUVEC 管腔形成。血管损伤后自噬表达水平的改变可促进血管再生，我们考虑能否通过调控自噬促进心肌梗死后心脏血管再生，从而改善患者心功能，还需要进行更深层次的研究。

2.2 自噬抑制血管生成 赵璇等［18］以HUVEC 为模型的高糖诱导实验发现，酸性自噬泡的生成与VECs 中的LC3B Punctas 数量和高糖增加关系密切，且高糖的增加会上调LC3B-Ⅱ蛋白表达，选择性自噬接头蛋白p62（Sequestosome-1，SPSTM1）蛋白表达作为自噬底物虽然不受影响，但会促进细胞凋亡核心成员半胱天冬酶（caspase）的切割底物，多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）蛋白的切割，而在此基础上予以新型丁内酯衍生物 3-苄基-5-（2-硝基苯氧甲基）-γ-丁内酯（3BDO）处理则可实现对LC3B Ⅱ表达下调和对PARP-1 蛋白表达切割。有学者［1-2］研究发现，自噬相关蛋白-7（ATG-7）被敲除或利用3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）抑制时，血管生成抑制情况减轻。神经母细胞瘤组织中的血管生成同样受胃泌激素释放肽及其受体的表达影响，参与了细胞自噬的负性调控［3］。

3 血管生成过程中自噬信号通路的调控机制

自噬信号通路主要有AMPK 信号通路、Notch信号通路等。 自噬相关AMPK 信号通路可通过调控单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶的表达，调控血管生成。Notch 信号通路等信号通路通过CBF-1/RBP-Jκ依赖途径、CSL 非依赖途径调控心肌缺氧损伤，保护心肌细胞，促进血管生成。

3.1 AMPK 信号通路在血管生成过程中的调控机制 自噬信号通路参与单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（5’-Amp-activated protein kinase，AMPK）的功能表达，调控血管生成。AMPK 有三种（ɑ、β、γ）亚基，主要分布在肾、肝、心、脑和胰岛组织中。心血管疾病发生时，由于线粒体自噬（mitophagy）稳态失衡，细胞内环境的稳态受破坏而影响血管功能。由于细胞多处于代谢应激状态，胞内AMP 表达随之升高或促进 AMP/ATP 比值上升，AMP 通过与及 γ 亚基结合，促进ɑ 催化亚基第172 位的苏氨酸进行磷酸化，当ɑ催化亚基被激活时，继而使AMPK信号通路被激活。研究［19-21］发现，心血管疾病患者细胞中的 AMPK 还可被5’-AMP 别构和瘦素、抵抗素、脂联素等激活，而参与到心血管疾病的发生、发展。AMPK 信号通路在心血管疾病演变过程中可能扮演介导信号通路。血管生成是发育、生殖和组织损伤修复的必要条件。正常生理条件下真核细胞内的AMPK含量极低，多处于无活性状态。心血管疾病等发生时，由于真核细胞处于缺氧或低能量等应激状态下，AMP/ATP 比值随之升高，导致AMPK 激酶系统被迫开启，迫使消耗ATP 途径关闭和ATP 再生途径启动。同时，当AMPK 信号通路激活时，机体中的氧诱导因子-1α（hypoxic inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等血管生成因子表达上调，促进血管生成，改善局部供血、供氧以应对血管损伤部位缺血缺氧的应激反应。另外，微血管密度（micro-vessel density，MVD）增加和内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）降低也与AMPK 信号通路自噬参与有关。综上，AMPK 信号通路介导的自噬在心血管疾病的血管生成中发挥了重要作用，可通过影响自噬水平调节血管生成的速率与程度。

3.2 Notch 信号通路在血管生成过程中的调控机制 Notch 信号通路作为一类高度保守的细胞表面受体，在脊椎动物、非脊椎动物机体中均广泛存在，对生物细胞的发育有极其重要的调节作用。Notch信号通路活化的途径主要分两条，过程极其复杂。首先经典的Notch 信号通路又称为CBF-1/RBP-Jκ依赖途径，它的传导需经3 次裂解（S1、S2、S3）方可实现［22-23］，最终使组蛋白乙酰化，胞内段（NICD）与CBF-1 无毛滞后抑制因子（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag，CSL）蛋白的结合，继而促使 CSL 蛋白由转录抑制物转变为转录激活物，激活靶基因的转录。其次是CSL非依赖途径，在此过程中Notch信号转导有三种调节方式［24］，即胞外水平、胞内水平、胞核水平。刘升通过构建急性心肌细胞损伤模型试验发现，当3-MA 和雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）试剂的最佳浓度（1μM和50nM）达到时，急性心肌细胞损伤患者的心肌细胞活力提高与Notch 信号通路1 过表达显著相关［25］。由此可见，Notch信号通路可通过增强自噬的方式，实现对心肌缺氧、复氧损伤调控，最终保护心肌细胞。经高通量测序及生物信息学分析系统筛选结果［26］来看，Notch信号通路1的关键miRNA 及 lncRNA 中，心肌自噬与 lncRNA-4321 表达量呈正相关，与miRNA-702-5p表达量呈负相关。简而言之，miRNA-702-5p 与 lncRNA-4321 是可结合的了miRNA-702-5p 与lncRNA-4321 可能参与调控Notch信号通路，继而参与心肌细胞的自噬活动。血管生成的过程包含内皮细胞分化为尖端细胞和茎细胞，并受 VEGF 和 Notch 通路的共同反馈调节［27］，Notch通路可通过负反馈机制抑制血管生成，更好的控制血管生成。

目前国内外临床均开展了靶向自噬治疗相关疾病，特别是血管性疾病的应用，且取得一定成效。针对血管生成的的自噬调控而言，如下几个治疗途径可行：①针对AMPK 介导信号通路在心血管疾病的血管生成机制，研发适应于不同病理环境的AMPK miRNA 激活剂、抑制剂并适度联用其他血管生成调控因子。②针对Notch 信号通路而言，同样可针对性的实施3-MA、RAPA 干预，充分利用Notch 信号通路在心肌自噬调控过程中的双重作用，开发能控制miRNA-702-5p 与lncRNA-4321 表达的抗体或相关靶向药物，实现自噬调控，并促进血管生成。

综上所述，细胞自噬在心血管疾病的发生发展中均发挥重要作用。自噬的生理功能主要有内源性管家机制、外源性防御和应激调控机制、特异性融合等。自噬对血管生成的调控具有双重性。干预自噬相关AMPK 信号通路、Notch信号通路等信号通路可以调控自噬水平，促进血管生成。