间充质干细胞旁分泌作用的研究进展

王媞尔 史明霞

昆明医科大学第一附属医院血液科，云南省血液病研究中心（昆明650032）

间充质干细胞（MSCs）是一组来源于中胚层间充质，具有自我更新能力、多向分化潜能特性的非造血成体干细胞，其普遍存在于外周血、骨髓、脐带、脐血以及脂肪等组织中。在合适的条件下，MSCs 可在体内或体外被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛样细胞、肝脏细胞、心肌细胞以及脂肪细胞等。

目前来说，MSCs 自身的低免疫原性和免疫调节特性已被应用于临床干细胞移植治疗，但是其免疫调节的可塑性等问题常导致MSCs的疗效出现异质性和不稳定性。近年发现MSCs移植的方案在实验或临床上不仅没有达到可用于治疗的水平，而且可能会出现异常分化、毒性、免疫反应、栓塞形成和发生肿瘤的风险［1］，这些因素均会导致MSCs 的应用被限制。不少研究发现，在经体外培养后，MSCs的归巢率也出现了明显降低。有证据表明，移植的MSCs 在靶组织中实际能够定位且存活的量极少，且它不是依靠分化机制而是以旁分泌的方式来发挥改善器官功能及调节治疗的作用［2］。

MSCs 不但可以合成和分泌广泛的可溶性因子（细胞因子、生长因子和趋化因子），也可以分泌细胞外囊泡（EV）。前者对其周围的细胞的确可以产生部分影响［3］，但无一能够充分表现MSCs 的功效。而后者是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40 nm 到1 000 nm 不等，主要由微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌体（exosomes，Exs）组成，它们一旦释放到细胞外环境中，可以通过旁分泌调节作用于附近的受体细胞，来介导对其他细胞的作用。MVs 是细胞在损伤、激活或凋亡后由细胞膜向外脱落释放的小囊泡（直径约为100 ～1 000 nm）；Exs 是首次在绵羊网织红细胞上清液中被发现的一种膜性囊泡（直径30 ～150 nm），主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成多泡体，经多泡体外膜与细胞膜融合后分泌到胞外，其携带有母细胞中的蛋白质、核酸以及脂质等重要成分［4］。

目前大部分培育的哺乳细胞类型都可以分泌EVs，且广泛存在于血液、唾液、脑脊液、尿液和乳汁等体液中。许多文献记载，差速超速离心法是EVs 分离提取技术中最常用的方法。但为了保持提纯率和特异性的稳定，近年来多数研究者将此法联合其他技术一并使用，例如密度梯度、过滤、沉淀、大小排斥层析和免疫分离法等；并且开发出其他技术或技术组合的多项互补法，其效果明显优于单一方法。在制备EVs 方面，尽可能完善对其来源的定量检测，保证内含物的丰富性、维持其特异性亦是必要的［5］。

人们逐渐发现EVs 与细胞疗法明显不同的是其相对稳定和可存留，并在同种异体给药后呈现出的免疫排斥率亦较低［2］。以往关于细胞间作用的多数研究主要关注在MSCs产生的可溶性因子方面，而目前了解到EVs 才是胞间通讯的真正的重要介质［6］，且MSC-EVs 不仅具有母细胞的生物学活性，也能规避在MSCs 治疗应用中的弊端，成为潜在的治疗方法或治疗剂的运送载体［7］。

1 在心肌修复中的研究

近年来，我国冠心病的发病率逐年升高，而心肌再灌注治疗策略对于心肌梗死的患者尤显重要。在冠状动脉发生部分或急性阻塞后，予以再通治疗，虽其目的是为了恢复心肌供血、减少损伤或持续坏死的心肌细胞，但在此过程中可能会通过激活某些信号转导通路而致心肌细胞死亡和功能恶化，发生心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischaemia/reperfusion，MI/R）［8］。然而，当血管再通后，在缺血期引起的损伤却更加凸显，甚至会发生严重的心律失常而致猝死，如在心内直视手术、冠状动脉搭桥术或腔内成形术、溶栓术后以及心肌内侧支循环血量突然增加等情况下可能出现［9］。目前其发生机制尚未明确，但有研究表明可能与细胞内氧自由基增多［10］、钙超载、炎症反应以及能量的代谢紊乱等因素的参与有关［11-12］。现今尚无明确有效治疗MI/R 的方法，人们将眼光聚焦于药物和细胞治疗的方向，但考虑药物治疗有时间依赖性，遂MSCs 治疗MI/R 逐渐成为研究者应用治疗的新目标。此外，在干细胞移植治疗中，暂无很好办法使MSCs 有效分化为心肌细胞，且移植中有很多副作用问题尚未明确，但Exs 修复损伤组织的能力却逐渐被发现。当缺血再灌注后，MSC-EVs 可以通过传递miRNA或某种蛋白质来调节能量的代谢平衡、避免钙过载、激活促存活通路、抑制死亡受体通路以及改善缺血微环境来进一步抑制细胞的凋亡。MAO 等［13］将转染了KLF3-AS1 基因的hMSCs-Exs 注射至心肌梗死大鼠模型中，或用hMSC 条件培养液培养缺氧心肌细胞，发现hMSCs-Exs 中KLF3-AS1的过表达可以显著减少心肌梗死面积，减少细胞凋亡，且Exs 抑制剂可以逆转条件培养液中促进细胞存活的功能。有观点认为MSCs-Exs 可以通过miR-182 调节巨噬细胞的状态来减轻小鼠心肌I/R损伤［14］。此外，MSC-Exs 还可通过诱导心肌细胞的自噬，来减少细胞凋亡，促进心功能的改善［15］。

2 在呼吸系统中的研究

有研究发现MSCs 在减轻多种类型的肺损伤治疗中是安全且可行的［16］。MSCs 效应的重要作用是在损伤部位向特定细胞的分化，而不少研究发现，体内注射MSCs 的确可以改善损伤、减少破坏，但其在损伤部位的植入较少且存活短暂，分化程度也非常低，发挥保护机制的主要是其释放的旁分泌因子［17］，且条件培养基可以同细胞一样发挥促进修复及分化的作用［18］。慢性阻塞性肺病易引起肺动脉高压（PH），常致右心衰竭及死亡，当今治疗手段仍无法彻底逆转病情的进展并改善生存率。王英宏等［19］发现大鼠的MSC-EVs 能明显减低自身的肺动脉压及右心室压力，缓解肺血管与右心室重构，减轻组织纤维化的程度，对炎症细胞发挥部分抑制作用。

近年支气管哮喘的发病率增长与气道反应性增高相关。MSCs 和调节性T 细胞（Tregs）均是强有力的免疫调节剂，Tregs 的异常增殖和功能在哮喘的发生发展中起至关重要的作用，而MSCs 可通过其免疫调节特性改善多种免疫介导的疾病。在小鼠模型全身施用MSC-EVs 能够通过miR-146a-5p抑制先天性淋巴样细胞在哮喘疾病中的主导功能，从而减轻气道高反应性［20］。有学者通过分离出MSC-EVs，研究其对哮喘患者外周血单个核细胞（PBMC）的免疫调节作用时发现，MSC-EVs 可上调PBMC 中IL-10 和转化生长因子β-1 的表达，促进Tregs 的增殖和免疫抑制能力，表明其在免疫调节中可发挥重要作用，且在治疗哮喘疾病中具备巨大潜力［21］，是极有前途的无细胞治疗剂。

3 在免疫调节中的应用研究

MSCs 由于自身突出的免疫抑制潜能已经在众多领域中获得了广泛的研究。近年来，许多临床前和临床试验研究表明，MSCs 在体内外的免疫抑制潜能可以改善许多免疫介导的疾病，如自身免疫性疾病，主要有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、急性移植物抗宿主病、自身免疫性肝炎、慢性肾脏病等，而支持MSCs 免疫调节作用的一个关键机制是产生旁分泌因子。

随着研究的进展，逐渐发现MSC-EVs 可能通过多种机制改善肾脏疾病模型中的肾脏损伤，包括急性肾损伤和慢性肾脏疾病，这些机制包括免疫调节和再生作用。例如，MSC-EVs 可通过降低炎性细胞因子表达水平和减少细胞凋亡来改善肾脏缺血再灌注损伤［22］。在环孢菌素引起的慢性肾脏毒性的小鼠模型中，予以MSCs 条件培养液似乎也会呈现出同MSCs 一样的优势效果，促进部分肾功能恢复，减少细胞凋亡和组织纤维化，进一步改善预后，表明MSCs 植入的细胞疗法并非是必要的［23］。

目前异基因造血干细胞移植是难治性血液病可能唯一的治疗方法，但易引起急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）的发生，此时抑制aGVHD 的出现是移植成功的关键环节。尽管皮质类固醇激素是aGVHD治疗的首要方案，但对类固醇激素耐药的患者可高达50%，致最终治疗效果欠佳［24］。后续发现MSCs可作为新的治疗方法，但考虑到MSCs临床应用的安全性问题及其分泌机制等因素，许多研究者选择使用MSC-EVs来进行临床前及临床试验研究。LI 等［25］在小鼠体内外实验研究中发现，人脐血源性的MSCs-EVs 可通过调节免疫反应来预防危及生命的aGVHD 的发生及降低其严重程度，显著提高了存活率。KORDELAS等［26］通过使用MSC-EVs 治疗aGVHD 患者后发现，MSC-EVs 可显著缓解患者腹泻、皮疹及感染等临床不良反应，从而减少类固醇用量，改善预后。

自身免疫性肝炎是一种难治型疾病，目前除类固醇激素外，暂未发现其他有效的医治方法。FENG 等［27］发现可通过利用MSC-Exs 作为载体的特性，使其携带microRNA-223-3p 运送到细胞内来调节免疫、抑制炎症反应、减轻肝损伤，为自身免疫性肝炎的治疗提供一个新兴的方向。

以上许多研究表明，MSC-EVs 的无细胞疗法已然成为免疫调节和治疗免疫介导性疾病的一种有潜在的安全疗法。

4 其他疾病中的应用研究

近年来，不少患者被神经损伤引起的神经病理性疼痛所困扰，且治疗困难。SHIUE 等［28］发现人脐带间充质干细胞（UCMSC）来源的外泌体可在大鼠神经损伤所致的疼痛模型中发挥有效的预防和逆转功效，同时兼具抗炎及前神经营养作用，也可将无细胞疗法认为是未来治疗神经损伤所致疼痛的新策略之一。XIE 等［29］在脐带血-间充质干细胞（CB-MSC）共培养系统中加入MSC-MVs 后，发现其能够显著提升脐血中CD34+细胞的扩增量，且原始祖细胞的增殖量也明显高于MSCs 共培养系统，在调节MSCs的造血支持作用上亦做出了贡献。SHI等［30］在大鼠尿道损伤模型中局部应用MSC-Exs 后证实其可减轻组织纤维化、促进血管生成，可有效防止尿道狭窄的出现。

5 小结及展望

MSCs 的旁分泌作用（特别是MSC-EVs）虽然使得无细胞疗法看似在治疗多种疾病中很有潜力，但在临床应用上仍然存在巨大的挑战，为了使其成为标准的诊断工具和更加优化的治疗方法，有待进一步的研究。