瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因的表达与酶学特性研究

马玉萍，薛天涵，成艳芬，朱伟云

(南京农业大学消化道微生物实验室，江苏 南京 210095)

半纤维素是自然界中除纤维素外含量最为丰富的可再生植物多糖，木聚糖是半纤维素主要组成成分，增加对植物木聚糖的降解效率能有效提高木质纤维素的利用效率。木聚糖由木糖分子以 β-1, 4-木糖苷键连结构成主链。异质多糖的木聚糖侧链含有种类各异的糖基，如阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等[1]。木聚糖酶是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合酶系，主要包括内切β-l, 4-D-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶[2]。木聚糖酶广泛应用于酿酒[3]、食品、饲料[4]等行业，高效合理地利用木质纤维素废弃物，能够促进环境友好的能源转化。

木聚糖酶的降解能力与序列来源、结合模块特异性及其个数、催化区域的特异性有密切联系[5]。根据木聚糖酶催化结构中序列的同源性，将其分为不同的糖苷水解酶家族，其中GH10、GH11家族被研究的最多。来源于GH10家族的木聚糖酶序列高达上千条，生物多样性丰富，因此具有很大的探索潜能。瘤胃内厌氧真菌对植物粗纤维具有高效的黏附和降解能力[6]，所以厌氧真菌被认为是比细菌和酵母菌更有潜力的木聚糖酶生产者[7]，但目前很少有来源于厌氧真菌的木聚糖酶被开发利用。本研究从厌氧真菌基因组中挑选4个GH10家族木聚糖酶基因，在大肠杆菌中进行异源表达后测定其酶学性质，为开发利用厌氧真菌木聚糖酶资源以及研究和改造GH10家族木聚糖酶基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

在厌氧真菌基因组中挑选出4个木聚糖酶基因(A、C、D和F)和氨基酸序列，根据大肠杆菌基因编码的偏好性，合成酶基因序列(上海生工生物有限公司)。质粒(pET-28a)、大肠杆菌BL21(DE3)与DH5α均购自上海生工生物有限公司，卡那霉素作为抗生素使用浓度为100 μg/mL。

1.2 主要试剂和培养基

DNA聚合酶与T5核酸外切酶购自 TaKaRa 公司；IPTG、卡那霉素(Kan)、DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和SDS-PAGE试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；DNA Marker和蛋白质分子量标准购自MBI公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)购自索莱宝公司；燕麦木聚糖购自Sigma公司；低黏度小麦阿拉伯木聚糖、中黏度小麦阿拉伯木聚糖、高黏度小麦阿拉伯木聚糖、不可溶小麦阿拉伯木聚糖、山毛榉木聚糖、高黏度黑麦阿拉伯木聚糖、罗望子木葡聚糖购自上海甄准生物科技有限公司；镍珠购自HUACHUN公司；其他常规生化试剂均为国产分析纯产品。

LB培养基含：酵母粉0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g，蒸馏水定容至100 mL，121 ℃高压灭菌20 min。固体培养基：100 mL LB培养基中加2 g琼脂粉。

1.3 目的基因的克隆及重组质粒转化表达菌株

设计带有同源臂的引物(表1)扩增4个木聚糖酶基因序列及pET-28a载体。目的片段扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。载体循环扩增延伸时间为1 min，其余条件不变。PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，验证条带大小正确之后用胶回收试剂盒回收纯化。利用T5核酸外切酶连接载体和片段并转化大肠杆菌DH5α 感受态，根据卡纳抗性筛选单克隆重组子并测序。测序正确的单克隆用质粒小提试剂盒抽取质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态，将感受态涂布在含有卡那霉素的固体LB培养基上，37 ℃过夜培养。

表1 载体与4种木聚糖酶基因扩增PCR引物

1.4 木聚糖酶的表达和纯化

挑取阳性克隆的转化子在含卡那霉素液体LB培养基中37 ℃、220 r/min培养为种子液。按照1%体积的接种量把种子液转接进入大体系的液体LB培养基，37 ℃、220 r/min培养菌液OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，18 ℃、220 r/min再诱导表达16 h。诱导结束后以8 000 r/min的速度离心10 min弃上清收集菌体，菌体用裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8.0, 500 mmol/L NaCl)洗1遍。将菌体重悬至OD600=10左右，加入1%体积的重悬液100 mmol/L PMSF，冰上超声裂解细菌，超声结束后加入0.1%体积的重悬液100 mmol/L PMSF。裂解后的菌液以10 000 r/min的速度离心30 min，收集上清与镍珠在4 ℃下结合1～2 h后，用含10～200 mmol/L咪唑的裂解缓冲液梯度洗脱。收集各个梯度的洗脱液用SDS-PAGE检测目的蛋白，选择不具有杂蛋白的洗脱液用30 kDa的超滤管浓缩换液至储存buffer(20 mmol/L Tris-HCl, pH=8.0, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 1 mmol/L EDTA)中。

1.5 酶活性质的测定

木聚糖酶活力测定采用1959年Miller 等建立的DNS法。使用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。在最适反应pH和温度下，每分钟降解木聚糖生成1 μmoL木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U，比酶活是单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。

试验中所有种类的木聚糖底物浓度均为0.01 g/mL。以燕麦木聚糖为底物，测定木聚糖酶最适pH值、pH稳定性、最适温度、温度稳定性及金属离子稳定性。最适pH值测定条件为：反应温度37 ℃，pH值梯度从3.0至11.0，反应时间30 min。pH稳定性测定条件为：选择最适pH值及最适pH值左右两个pH点，37 ℃孵育，隔一定时间取样测定剩余酶活。最适温度测定条件为：pH=7.0(0.1 mol/L Tris-HCl)，反应温度为18 ℃、28 ℃、37 ℃、45 ℃、53 ℃、62 ℃，反应时间30 min。温度稳定性测定条件为：选择最适温度及最适温度左右两个点，即木聚糖酶A、C、F在温度28 ℃、37 ℃、45 ℃下孵育，木聚糖酶D在温度18 ℃、28 ℃、37 ℃下孵育，隔一定时间测定剩余酶活。金属离子稳定性检测条件为：在酶促反应体系中分别加入终浓度为5 mmol/L 的金属离子(Ca2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Co3+)，在pH值为7、温度为37 ℃下反应30 min。对照组(CK)为不含任何金属离子的酶促反应体系。

底物特异性检测时，分别选择低黏度小麦阿拉伯木聚糖(WAL)、中黏度小麦阿拉伯木聚糖(WAM)、高黏度小麦阿拉伯木聚糖(WAH)、不可溶小麦阿拉伯木聚糖(WAI)、燕麦木聚糖(X)、山毛榉木聚糖(BX)、高黏度黑麦阿拉伯木聚糖(RAX)以及罗望子木葡聚糖(ATX)为底物，在最适pH值和最适温度下反应30 min测定酶活。

1.6 数据分析

利用ProtParam tool of ExPASY(ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam/)软件分析木聚糖酶的分子量大小、等电点、不稳定系数。采用 SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA 过程进行单因素方差分析，Duncan法进行各组间多重比较，以P<0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶序列分析与克隆表达

4种木聚糖酶基因A、C、D和F片段长度分别为1 347、1 428、1 359和1 446 bp，其理论蛋白分子量分别为49.87、54.59、50.37和54.86 kDa；理论等电点分别为8.52、4.67、9.10、4.36；理论不稳定系数分别为26.54、32.02、24.30、38.32，都为稳定类蛋白。

4种厌氧真菌木聚糖酶的表达见图1，SDS-PAGE显示，4种木聚糖酶蛋白质分子量分别为75、70、52和73 kDa，其表达产物以胞内可溶性蛋白和不溶性包涵体形式存在。

M. 蛋白分子量标准；1. 木聚糖酶A；2. 木聚糖酶C；3. 木聚糖酶D；4. 木聚糖酶F图1 厌氧真菌4种木聚糖酶的SDS-PAGE分析

2.2 pH对4种木聚糖酶活性的影响

4种木聚糖酶最适pH值如图2所示，其反应最适pH值均为8.0。木聚糖酶pH稳定性结果如图3所示，木聚糖酶A在pH值为7.0、8.0、9.0下酶活都很稳定，具有很高的pH耐受性；木聚糖酶C对pH值为9.0的稳定性要优于pH值为7.0、8.0，在长达20 h的时间内该酶仍保留有90%的活性；木聚糖酶D在孵育初期，酶活迅速下降到60%，其pH稳定性较差；木聚糖酶F在pH值为9.0条件下稳定性较好，pH值为7.0和8.0条件下，孵育20 h后酶活迅速下降。

图2 4种木聚糖酶最适pH值测定

图3 4种木聚糖酶的pH稳定性

2.3 温度对4种木聚糖酶活性的影响

木聚糖酶D最适反应温度为37 ℃，其余3种木聚糖酶最适反应温度为45 ℃(图4)。木聚糖酶温度稳定性结果如图5所示，木聚糖酶A在孵育温度为37 ℃时随着时间延长酶活有所提高；木聚糖酶C在37 ℃时有很好的稳定性，24 h之内酶活基本无变化，而随着孵育温度升高酶活的稳定性变差；木聚糖酶D在孵育温度为28 ℃下酶活衰减较慢，而在37 ℃、45 ℃下孵育1 h后酶活衰减到原有酶活的75%，在酶活下降到75%之后保持基本不变； 木聚糖酶F在最适温度45 ℃下稳定性最好。

图4 4种木聚糖酶的最适温度

图5 温度对4种木聚糖酶活性的影响

2.4 金属离子对4种木聚糖酶活性的影响

金属离子对4种木聚糖酶活性的影响见图6。对木聚糖酶A的酶活具有明显促进作用的金属离子有Ca2+、Mn2+、Mg2+(图6)，具有明显抑制作用的金属离子有Zn2+、Cu2+、Co3+；对木聚糖酶C的酶活具有明显促进作用的金属离子有Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+，具有明显抑制作用的金属离子有Zn2+、Cu2+；对木聚糖酶D的酶活具有明显促进作用的金属离子有Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+，具有明显抑制作用的金属离子有Zn2+、Cu2+、Co3+；对木聚糖酶F的酶活具有明显促进作用的金属离子有Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co3+，具有明显抑制作用的金属离子有Zn2+。Ca2+对4种木聚糖酶的酶活促进作用最强，最高达到4倍促进作用。

注：字母相同表示差异不显著(P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)。下同图6 金属离子对4种木聚糖酶活性的影响

2.5 底物对4种木聚糖酶活性的影响

底物对4种木聚糖酶活性的影响见图7。4种木聚糖酶对山毛榉木聚糖的亲和力显著高于其他底物(P<0.05)。木聚糖酶A、C对4种不同的小麦阿拉伯木聚糖的降解效率没有显著差异(P<0.05)，木聚糖酶D、F对罗望子木葡聚糖的降解效率显著低于其他底物(P<0.05)。

图7 底物对4种木聚糖酶的影响

3 讨论

木聚糖位于木质素和纤维素的中间交界处，在连接两者的同时，木聚糖对维持植物细胞纤维的凝聚力和细胞壁的完整性起着重要作用[8]，是降解木质纤维素的重要阻碍之一，生物酶解是提高废弃农作物利用率的主要手段之一。目前关于木聚糖酶的研究主要包括筛选高产木聚糖酶菌株、构建多效复合酶、优化培养及工艺条件、定向改造酶学性质等。但如何获得低成本、高催化效率的木聚糖酶仍然是实际工业生产的主要瓶颈问题。瘤胃中存在许多能够高效降解木质纤维素的厌氧真菌，相较于其他途径制得的木聚糖酶活性会更高[9]，因而其更具有开发潜能。

本研究发现，木聚糖酶A、C和F都具有良好的pH值和温度稳定性，这一特性在酶工艺生产中占据很大的优势，还可以通过分析基因序列对定向改造酶的稳定性提供参考。Ca2+能提高4种木聚糖酶的酶活并且效果显著，可能是由于Ca2+作为辅因子增加了金属离子结合位点的亲和力使蛋白更加稳定, Pantoliano等[10]以枯草杆菌丝氨酸蛋白酶为模型发现一定浓度的Ca2+能有效提高酶的动力学稳定性。曾霖霖等[11]发现Ca2+对菠萝蛋白酶的酶活和热稳定性都具有促进作用。本研究中的4种木聚糖酶对除山毛榉木聚糖外其他底物降解效率低，可能是由于这4种木聚糖酶作用的糖苷键单一或者没有经过更完整的表观遗传修饰导致功能不全[12]。由于4种木聚糖酶都来自于糖苷水解酶第10家族，而该家族的酶主要包含内切木聚糖酶、内转换糖基化酶、内切β-1, 4葡聚糖酶。山毛榉来源的木聚糖中木糖成分占比高达82%，而在小麦阿拉伯木聚糖(低、中、高黏度)和黑麦阿拉伯木聚糖中木糖占比60%左右，阿拉伯糖占比38%左右。由于木聚糖酶无法有效作用于阿拉伯糖基进而无法高效降解小麦阿拉伯木聚糖，所以这4种木聚糖酶对小麦阿拉伯木聚糖的降解能力低于山毛榉木聚糖。底物结构中木糖所占比例、侧链糖基类型决定了4种木聚糖酶对底物的降解能力。

目前纤维素酶基因、花生条纹外壳病毒蛋白基因都是用大肠杆菌表达，因为大肠杆菌基因背景和表达调控过程清楚，培养周期短。本研究中，大肠杆菌表达的厌氧真菌来源的木聚糖酶比酶活相对较低，可能是因为4种木聚糖酶为真核蛋白，在大肠杆菌的原核表达过程中，没有经过完整修饰导致酶活下降。Wu等[13]把来源于人纤溶酶原的Kringle - 1结构域与链激酶的C-末端融合，分别进行真核表达和原核表达，结果表明原核表达的融合蛋白没有生物活性，而毕赤酵母表达的融合蛋白由于N-端发生糖基化而具有生物功能。戴建华等[14]发现鸡γ-干扰素基因在原核表达产物以包涵体形式存在并无抗病毒活性，而在真核细胞表达产物抗病毒效价却很高。

4 结论

本研究在大肠杆菌中成功表达了4种来自瘤胃厌氧真菌的木聚糖酶基因，这4种酶具有良好的pH值和温度稳定性，对山毛榉木聚糖的亲和力最高，Ca2+具有明显的酶活促进作用。本研究获得的4种木聚糖酶具有潜在的工业应用价值，为探索瘤胃中粗纤维降解资源提供参考。