临床疑似病例中火鸡组织滴虫的检测及其在脏器分布规律

戎杰，孔令明，陈乔光，侯照峰，刘丹丹，陶建平，许金俊*

(1. 扬州大学兽医学院,江苏 扬州 225009；2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

组织滴虫病又称黑头病或盲肠肝炎，是由火鸡组织滴虫(Histomonasmeleagridis)引起的一种禽类原虫病，以盲肠肿大、肝脏严重坏死以及排硫磺样粪便为主要临床特征[1-2]。多年以来，化学药物一直是防治组织滴虫病的主要手段，发挥了巨大的作用。由于对人体潜在的毒性和致癌性，欧盟已完全禁用所有对组织滴虫病具有疗效的化学药物，美国也已禁止使用除硝基苯胂酸以外的其他化学药物[3]，我国农业部第193号公告中也将硝基咪唑类药物列入《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》[4],因而导致该病在鸡群和火鸡群中大量暴发和流行，造成了严重的经济损失[5-6]。尽管部分天然植物提取物已被证实对虫体的体外繁殖具有一定的抑制作用，但对自然或人工感染的组织滴虫病疗效甚微[7]，因此，针对该病的安全可靠的新药或疫苗的研制显得尤为迫切。

火鸡组织滴虫人工感染后在禽类体内的分布规律有少量报道[8]，而自然感染鸡组织脏器中虫体的分布规律还不太清楚。本研究通过对2018年4至5月期间扬州大学动物医院21例临床疑似组织滴虫病的病鸡体内321个脏器组织中虫体DNA 的PCR检测，揭示临床自然感染鸡组织脏器中虫体的分布规律，为阐明火鸡组织滴虫的致病机理和传播途径，以及药物和疫苗的效果评价提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 临床病料

病料来自于2018年4至5月期间扬州大学动物医院接诊的组织滴虫病临床疑似病例21例，这些病鸡来自于江苏省扬州市及周边地区，有散养草鸡、商品蛋鸡、三黄鸡等多个品种，年龄通常在1至2月龄。所采取的组织脏器有：肝脏、胰腺、胆囊、食道、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、气管、肺脏、心脏、肾脏、脑、脾脏、法氏囊和盲肠扁桃体共19种组织器官，共有321份组织器官样品。

1.2 主要试剂

DL2000 Marker、MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒Ver.5.0购自TaKaRa公司；1 kb DNA Ladder、10×PCR Buffer、dNTP mix、TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程有限公司；含火鸡组织滴虫 18S rRNA 基因的阳性质粒 pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 由本实验室构建并保存；其他试剂为国产分析纯。

1.3 样品DNA的提取

按照TaKaRa公司的DNA提取试剂盒说明书进行，用NanoDrop2000测定纯度和浓度后-20℃冻存备用。

1.4 脏器中火鸡组织滴虫虫体DNA的PCR检测

按照参考文献[9]设计扩增火鸡组织滴虫18S rRNA基因片段的引物，预期扩增片段576 bp,引物由北京六合华大基因公司合成，序列如下：F1:5′-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3′；F2:5′-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3′。PCR反应体系总体积为25 μL：ddH2O 18.25 μL，10× PCR Buffer 2.50 μL，10 mol/L dNTP mix 2.00 μL，10 μmol/L F1 0.50 μL，10 μmol/L F2 0.50 μL，50 ng/μLTaqDNA聚合酶0.25 μL，DNA模板1.00 μL。反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。采用1.2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，EB染色15 min，凝胶成像系统下观察并拍照。每次PCR检测时设立pGEM-T-Easy-HM 18S rRNA 为模板的阳性对照和以灭菌水为模板的阴性对照。

2 结果

2.1 病鸡临床表现和剖检变化

病鸡临床表现为：精神沉郁、缩头垂翅、被毛蓬乱而无光泽、呆立或聚堆，排黄绿色稀粪，粪便中甚至有时带有组织碎片和血液。病鸡解剖可见：肝脏肿大，表面存在稍凹陷的圆形溃疡灶，数量和大小不等，有时会相互融合形成大面积溃疡区(图1A)，少数病鸡肝脏上黄白色的坏死点散在分布(图1B)；盲肠则显著肿大，盲肠壁增厚明显，内有栓塞物，黏膜呈现出血、坏死和溃疡(图1C)；其他组织脏器病变不明显。

A：典型肝脏病变；B：非典型肝脏病变；C：典型盲肠病变图1 疑似组织滴虫病病鸡的肝脏与盲肠

2.2 PCR检测

将临床病料组织样品提取DNA后进行PCR检测，部分脏器的PCR检测凝胶电泳结果见图2，其中阳性对照在576 bp处有条带，样品中呈阳性的在576 bp 处也出现条带，而阴性对照无条带。所有样品的PCR检测统计结果见表2。由表2可见，不同脏器虫体检出率不同，其中肝脏和盲肠检出率最高，分别为57.1%和52.4%；回肠、脾脏、肾脏、肌胃、胰腺和脑的检出率依次为43.8%、40.0%、40.0%、37.5%、35.7%、33.3%；心肺及其他肠道组织甚至法氏囊等检出率都较低，低于30%；胆囊的检出率为0。

表2 321份组织样品PCR检测结果

M. DL2000 Marker; 1.阳性对照；2.阴性对照；3.肝；4.脾；5.肺；6.肾；7.脑；8.回肠；9.肌胃；10.腺胃；11.胰腺；12.十二指肠；13.气管；14.食道；15.法氏囊；16.盲肠；17.直肠；18.盲肠扁桃体；19.胆囊图2 部分疑似病鸡组织器官的虫体DNA PCR 扩增结果

3 讨论

关于火鸡组织滴虫在人工感染鸡火鸡体内的检测与分布规律，国内外有过一些研究和报道。禚振男[10]使用实验室分离纯培养的火鸡组织滴虫单克隆虫株 JSYZ-A 株经泄殖腔感染 15日龄苏禽黄羽肉鸡，并在感染后不同时间采取12个脏器样本进行 PCR 检测，结果发现盲肠与肝脏分别在第13天和 第 16天时检出率最高达到 100%，随后降低；从第10天开始可以发现在十二指肠、空肠、直肠和脾脏中能检测到火鸡组织滴虫；至感染第13天后可检测到腺胃和心脏均有火鸡组织滴虫存在；在感染第19天后的肺脏中才能检测到虫体。说明火鸡组织滴虫主要寄生于盲肠和肝脏，在十二指肠、空肠、直肠、脾脏、腺胃及心脏等也会出现虫体感染。而Singh等[11]运用多克隆抗体免疫组化技术，成功地在试验感染火鸡的多个器官中定位了火鸡组织滴虫抗原，发现盲肠、肝脏、肺、脾检出率为 100%，法氏囊检出率为60%，心脏、小脑、前胃、胰腺等检出率较低。孔令明等[12]将 JSYZ-A 株虫体通过泄殖腔感染15日龄苏禽黄羽肉鸡，在感染后1～34 d内，每3 d扑杀5只感染鸡，采集其不同组织脏器样品，并对样品进行PCR检测。试验结果表明肝脏、盲肠、十二指肠、空-回肠、直肠、腺胃和法氏囊均检测到火鸡组织滴虫，肝脏、盲肠存在时间最长，同时脾、肺和脑等组织也检测到了火鸡组织滴虫，在肾脏和胰脏中并未发现火鸡组织滴虫。Lotfi等[13]通过人工感染试验也观察到鸡肝脏与盲肠以外器官的病理变化，并在肺和脾等组织中检测到组织滴虫的存在。本次自然感染鸡脏器分布结果与人工感染获得的结果基本一致，同时脏器分布上也存在一定微小差异，这些差异与人工感染虫株的毒力、试验动物的种类、观察的时间点等因素相关。

与人工感染试验后的脏器检出率较高相比而言，临床疑似病料中虫体DNA的检出率不高，究其原因，存在多方面的可能[14-15]。首先，肠道和粪便中含有一些TaqDNA聚合酶的抑制剂，会造成某些样品的假阴性结果，PCR方法对盲肠样品的检出率为52.4%，低于肝脏样品的57.1%，也证实了这种可能性的存在；其次，Bilic 等[16]也指出根据18S rRNA序列分析，各基因型间存在一定的遗传多样性，而同一基因型内的遗传异质性也存在差异，这可能也是检出率稍低的原因；此外，一些未知物种或与其他原生生物(如毛滴虫或四毛滴虫)的混合感染被认为是引起组织滴虫病的原因或引起与组织滴虫病类似的症状和病变，这也是临床样品中检出率不高的原因之一[17]。

综上，本研究系统地阐述了临床病鸡中火鸡组织滴虫体内的分布规律，进一步明确了其靶器官为盲肠和肝脏。除靶器官肝脏与盲肠外，也可通过检测回肠、脾脏和肾脏等检出率较高的组织脏器来确认是否感染，为组织滴虫病的临床诊治提供一定的参考，也为以后探究其致病机理和疫苗的研发奠定基础。