Nrf2为靶点治疗支气管肺发育不良的研究进展

张晗硕，梅 花，张亚昱

0 引言

支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是早产儿呼吸系统的一种常见病，被认为是继发性的高氧和炎症造成的氧化损伤，从而导致肺泡形成障碍和慢性肺功能障碍，其危险因素可分为个体因素、医源性因素和外部因素[1-2]。随着极低出生体重儿和超低出生体重儿存活率的不断增加,BPD已经成为早产儿呼吸系统最重要的合并症，严重者可并发肺动脉高压，影响远期呼吸功能、神经系统预后[3]。

Northway等[4]在1967年首次将BPD定义为因机械通气而导致的有呼吸窘迫综合征的早产儿产生的肺病。美国国立儿童健康与人类发育研究所于2001年发表了BPD的诊断和分度标准，后于2018年修定了更为细化的BPD定义及分度标准。中华医学会儿科学分会新生儿学组联合中华儿科杂志编辑委员会于2020年发表了更符合我国国情的BPD临床管理专家共识[5]。虽然新生儿护理的发展提高了早产儿的存活率，但在降低BPD发生率方面取得的进展有限[6]。我国几项多中心报道的BPD发生率差异较大[5]，其发生率居高不下的部分原因是可用于预防和治疗BPD的选择有限。所以,BPD仍是早产儿高发病率和高死亡率的主要原因，BPD的治疗也仍然是一个重要的临床问题。

1 Nrf2概述

核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2related factor 2,Nrf2)由605个氨基酸组成，分为7个功能域，分别称为Neh1～Neh7：Neh1结构域含有1个亮氨酸拉链结构(CNC-bZIP)，为DNA结合域；Neh2结构域是1个N端调节结构域，包含7个影响泛素结合的赖氨酸残基和2个肽结合基序(ETGE和DLG)，ETGE和DLG基序与Keap1相互作用，它们通过促进Nrf2与不同蛋白质的结合来调节Nrf2的稳定性；Neh3结构域为染色质解螺旋酶DNA结合蛋白6结合域；Neh4和Neh5结构域为转录因子结合域；Neh6为β- 转导重复相容蛋白(β-TrCP)结合域；Neh7结构域为视黄酸Ⅹ受体α(RⅩRα)结合域[7-10]。

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)由624个氨基酸组成，分为5个结构域，其中包含的Kelch重复序列被认为介导Keap 1与Nrf2和p62蛋白的结合[11-12]。平衡条件下，Keap1通过N-末端BTB结构域进行同二聚化，并与Cull 3 E3连接酶结合，形成Keap 1-Cull3-RBX1(环盒蛋白-1) E3连接酶复合物，导致Nrf2泛素化和降解；在应激条件下，Nrf2从Keap1-Cul3-RBX1复合物中释放出来，转移到细胞核中与小Maf蛋白(sMaf)异二聚体化，并与抗氧化反应元件(AREs)结合，导致ARE驱动基因的转录[13]。Nrf2/ARE通路在维持细胞氧化还原稳态方面发挥重要作用[14]，该通路可调控谷胱甘肽和硫氧还蛋白抗氧化系统关键组分的表达，参与内外源代谢产物的Ⅰ期、Ⅱ期解毒，调节还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生和血红素代谢，同时亦与许多肿瘤、炎性疾病、神经退行性疾病密切相关，已成为新型治疗靶点[15-17]。

2 Nrf2为靶点治疗BPD的依据-Nrf2对BPD的保护作用

由于人们经常暴露在外部环境中，接触各种污染物和其他氧化剂，所以Nrf2维持的氧化还原平衡对呼吸道相当重要。目前研究显示，Nrf2缺失会导致各种呼吸系统疾病的高度易感性和严重损伤，包括BPD、呼吸道感染、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、特发性肺纤维化和肺癌等，相反，Nrf2的激活对这些肺部疾病具有保护作用[15]。

Chu等[18]将早产大鼠暴露在高氧环境中，结果早产大鼠肺发育迟缓，其病理变化与BPD相似，发现早产大鼠高氧暴露后，Nrf2和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达明显增加，具有保护作用。Zhang等[19]检测了早产SD大鼠肺组织和高氧暴露的A549细胞中Nrf2和miR-125b的表达水平，发现早产大鼠肺组织中Nrf2和miRNA-125b在高氧暴露后明显升高，具有保护作用。

Ma等[20]实验发现，高氧组早产儿动物模型Nrf2和HO-1基因和蛋白的表达明显高于对照组，并且发现BPD患儿的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性与对照组有显著差异。Lin等[21]研究表明，Nrf2/HO-1轴可能在气体递质对BPD的保护作用中起核心作用。McGrath-Morrow等[22]研究发现，Nrf2能够增加新生小鼠暴露于高氧的存活率，并且Nrf2可能有助于减轻高氧暴露引起的肺泡生长抑制。

以上研究验证了Nrf2在BPD中的保护作用，提示Nrf2在BPD的防治方向上的巨大潜力。

3 以Nrf2为靶点治疗BPD及其相关药物的研究进展

Nrf2转录因子对细胞保护反应至关重要，而Keap1作为一种Nrf2信号的内源性抑制剂，会抑制这些保护反应。暴露于高氧的Nrf2充足(野生型)新生小鼠出现肺泡发育不良，这一现象与人类BPD病相似，Nrf2缺乏使其恶化。Tamatam等[23]使用了带有亚型Keap1 floxed等位基因(Keap1)且Nrf2水平增加的生后1d(PND1)幼鼠，以检验早产肺中Nrf2的组成水平不足以减轻高氧诱导的肺泡发育不良的假设，Keap1幼鼠不伴有肺泡生长抑制且抗氧化基因和谷胱甘肽表达水平增加，Keap1敲除导致出生后肺细胞增殖上调，但在高氧后有相反的作用。这项研究表明，通过靶向Keap1来增强内源性Nrf2的激活，可能提供了一种防治BPD的生理学方法。

Zhao等[24]实验发现，自噬激动剂雷帕霉素可以通过抑制p62磷酸化，促进Keap1降解，增加Nrf2核转运，增加下游抗氧化酶表达，增强抗氧化能力，从而改善BPD大鼠肺泡结构的简化。这提示使用自噬激动剂来增强Nrf2-ARE通路活性并促进肺泡发育，可能是BPD抗氧化治疗的新靶点[25]。

Cho等[26]利用新生Nrf2缺陷型[Nrf2(-/-)]和野生型[Nrf2(+/+)]小鼠，研究了Nrf2介导的分子事件在囊状到肺泡型肺成熟过程中的作用，以及Nrf2在高氧性肺损伤发病机制中的作用。与Nrf2(+/+)新生儿相比，Nrf2(-/-)新生儿肺组织细胞周期、氧化还原平衡和脂质/碳水化合物代谢基因的基础表达降低，而淋巴细胞免疫基因高表达，在Nrf2(-/-)新生儿中，高氧诱导的表型，包括死亡率、囊泡期向肺泡期转变的停止、肺水肿、伴随DNA损伤和组织氧化的炎症明显比Nrf2(+/+)新生儿严重，新生儿期Nrf2缺乏加重了新生儿高氧所致的肺损伤和肺泡化的抑制。这提示了特异性Nrf2激活剂对包括BPD在内的氧化应激相关新生儿疾病有治疗潜力。

Dunigan等[27]研究了硫氧还蛋白还原酶-1(TXNRD1)抑制剂诱导HO-1的机制，HO-1被认为是ARDS和BPD的潜在治疗靶点。TXNRD1主要在气道上皮细胞表达，可有效激活Nrf2反应，减轻肺损伤，当TXNRD1被抑制时，HO-1与Nrf2靶标NADPH醌氧化还原酶-1(NQO1)不呈比例地增加，提示Nrf2是TXNRD1抑制剂增加肺上皮细胞HO-1的主要机制，可以成为BPD的治疗靶点。

DL-3-正丁基苯酞(NBP)是由L-3-正丁基苯酞合成的外消旋体，Gong等[28]探讨NBP对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的影响，结果发现，NBP可明显抑制脂多糖诱导的肺湿干比升高、肺组织损伤、炎细胞浸润、促炎细胞因子和趋化因子的释放以及氧化损伤，可增加脂多糖诱导的小鼠肺组织sirtuin1(SIRT1)和Nrf2的表达，结果表明，NBP能以SIRT1依赖和SIRT1非依赖的方式激活Nrf2抗氧化信号，从而减轻氧化应激、炎症和肺水肿，即有望达到治疗BPD的目的。

新生大鼠的肺对应于肺发育的囊状阶段和青春期前的人肺发育阶段，表现为总谷胱甘肽和过氧化氢增加，DNA和脂质氧化损伤，以及对高氧反应的抗氧化应激反应第二阶段介质(超氧化物歧化酶、血红素氧合酶-1和Nrf2/Keap1系统)的诱导。Endesfelder等[29]的动物实验表明，除了腺苷受体的药理拮抗作用外，咖啡因可能是一种有效的抗氧化剂，其减少氧化脱氧核糖核酸损伤，对氧化应激反应有保护性干扰，并调节高氧诱导的肺氧化应激反应，从而在BPD相关动物模型中具有保护作用。

间充质干细胞(MSCs)在许多人类疾病的治疗中有着广阔的前景，其具有免疫调节和抗氧化活性，胎儿来源的人胎盘间充质干细胞(HfPMSCs)具有很强的免疫调节作用。Yan等[30]采用hfPMSCs的细胞共培养模型和条件培养液(CM)，通过检测hfPMSCs清除氧化剂和自由基的能力以及保护肺泡上皮细胞免受抗氧化损伤的能力来检测hfPMSCs的抗氧化活性，结果表明，100 μM的维生素C具有一定的抗氧化能力，在单层和跨孔共培养模型中，CM单独和共培养的hfPMSCs均显示出保护A549肺泡上皮细胞免受600 μM过氧化氢(H2O2)暴露的氧化损伤的作用，与单纯对照组相比，hfPMSCs及其CM可显著降低HO诱导的肺泡上皮A549细胞的凋亡率，同时增加抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、NRF-2和HO-1的表达，降低促凋亡蛋白Bax、caspase 3和Keap1的表达。此外，从培养的hfPMSCs-CM中发现Nrf2/Keap1/ARE信号通路被抑制，导致A549细胞中caspase-3的表达显著降低，尽管加入Nrf2抑制剂ML385，仍对hfPMSCs-CM的抗氧化活性没有影响。这些研究数据表明，hfPMSCs至少部分地通过调节Nrf2-Keap1-ARE信号介导的细胞凋亡来保护HO诱导的细胞氧化损伤。

另外，小干扰RNA(siRNA)可抑制A549细胞中Nrf2的表达，抑制miR-125b的表达，并显著增加细胞凋亡率，提示miR-125b作为Nrf2的下游靶点有助于保护BPD[20]。McGrath-Morrow等[31]发现，Nrf2的激活提高了高氧暴露下新生小鼠的存活率，这可能是由于抗氧化反应基因的表达增加所致，尽管Nrf2的激活诱导了抗氧化基因的表达，但并不能减轻暴露于高氧所致的肺泡生长停滞。

4 Nrf2及其相关药物在其他疾病中的应用

Zheng等[32]的研究发现，地塞米松治疗哮喘的机制是通过调节Keap1-Nrf2通路，从而抑制哮喘小鼠肺部氧化应激水平。Keap1-Nrf2通路可以影响下游抗氧化反应元件的表达。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对体内细胞氧化应激的抑制作用可能的潜在机制是激活Keap1/Nrf2信号通路。

质膜结合的G蛋白偶联胆汁酸受体(TGR5)可通过促进Keap1-Nrf2信号通路的激活，有效减轻肝脏缺血再灌注损伤时的炎症反应，在多种肝病中起保护作用，这可能在减少相关炎症分子、调节固有免疫方面有一定意义[33]。

槐苷(SOP)是从槐籽中分离得到的一种异黄酮苷，具有抗癌、抗过敏、抗炎等多种药理活性，Wu等[34]的研究发现，SOP以AMPK/Nrf2依赖的方式减轻LPS诱导的ALI，提示SOP可能是治疗ALI/ARDS的潜在候选药物。

Ali等[35]探讨了马兜铃酸(CNT)在LPS诱导的急性肺损伤模型中的抗炎作用，CNT诱导Nrf2蛋白的表达，分子对接研究显示，其与Nrf2、P65、Keap1、HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2有显著的结合作用，并表现出良好的物理化学性质，CNT对LPS诱导的肺损伤有明显的保护作用，并能改善动物的行为、生化和组织学指标。

研究显示，Nrf2依赖基因Pparg可编码过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)[36]，PPARγ可对抗炎症引发的内皮细胞紧密连接蛋白，在调节基因介入的炎症反应中至关重要，而PPARγ的表达取决于 Nrf2。研究证实，抑制小窝蛋白酪氨酸残基14磷酸化可增加Nrf2的核内表达，从而增加其效应分子PPARγ及claudin-5的表达，这对减轻肺组织炎症、降低肺毛细血管旁渗透性具有十分重要的意义。

吴灿等[37]研究显示，银杏内酯B对四氯化碳诱导的肝纤维化具有明显的防治作用,其作用机制可能是通过调节Nrf2/HO-1和Bcl-2/Bax途径发挥作用，提示Nrf2在减轻大鼠肝纤维化方面的意义。

此外，Nrf2为肾脏疾病、肝脏疾病、心脑血管疾病、风湿疾病等诸多疾病的治疗提供新的治疗靶点[38-45]。其激活药物富马酸二甲酯目前在多发性硬化症的治疗中被批准应用[46]。

5 展望

综上所述，很多研究证实了Nrf2及其通路在BPD的作用，有望提供新的治疗靶点，但是目前研究尚不充分,且停留在动物实验水平，需要进一步的研究来证明Keap1/Nrf2信号通路在BPD的潜在机制。Nrf2已成为一个重要的预防和治疗靶点，许多天然和合成化学物质被认为是其调节剂,然而，越来越多的证据表明,Keap1-Nrf2-ARE调节的复杂程度远超于此，并且还涉及其他分子机制[10]。Nrf2在新生儿疾病领域的研究尚且不足，Nrf2和Keap1的表观遗传调控将成为未来研究的一个重要方向。我们需要更多的研究对目前可用的Nrf2诱导剂和抑制剂进行严格评估，探索Nrf2及其通路的调控措施，探索更成熟易检测的标志物，以期能够增加BPD的治疗靶点。