食管鳞癌患者血浆miR-106b-3p 和miR-214 检测的临床价值

王中平，范晓英，李亮亮，武京学，张文娟，董魁，马立东，乔冠恩(通信作者)

（1.邯郸市第一医院，河北 邯郸056002；2.邯郸市中心医院感染科，河北 邯郸056000；3.成安县中医院 内科，河北

邯郸056700 ；4.馆陶县人民医院 消化科，河北 邯郸 057750）

0 引言

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常见的消化道恶性肿瘤，具有极高的患病率和致死率，在所有癌症的患病率及致死率排名中，EC 分别为第8 位和第6 位[1]。根据病理学分类，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常见的EC 病理类型[2]，我国约90%左右EC 患者的病理学分型是ESCC。目前，我国ESCC 存在临床治疗效果不佳、预后较差的特点[3]，但到目前为止，ESCC 确切的病因及分子调节机制尚未完全阐明，因此，阐明ESCC 的发病机制非常重要。微小RNA（miRNAs）既可作为致癌分子也可作为抑癌分子，通过调控其靶基因的表达水平而对癌细胞的增殖、凋亡和转移等产生影响[4]。miR-106b-3p 和miR-214 在ESCC 中的具体功能，目前鲜有报道。本研究采用反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术检测ESCC 患者和健康者的血浆中miR-106b-3p 和miR-214 表达水平，并结合临床病理资料，探讨它们与ESCC 的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 ESCC 患者

取2016 年06 月至2017 年08 月邯郸市第一医院及苏州大学附属第一医院确诊的ESCC 患者的外周血，共40 例。其中男性23 例，女性17 例，年龄38～77 岁，平均（60.9±11.6）岁。所有患者均无其他肿瘤病史，釆取外周血标本前及手术前均未行放疗、化疗、生物治疗等干预措施。

1.1.2 健康体检者

收集30 例同期健康志愿者的外周血，均无肿瘤、高血压、糖尿病、心脏病等病史。与ESCC 患者在性别、年龄等情况无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂

Trizol 试剂及逆转录试剂盒购于美国Invitrogen 公司，PCR 试剂盒购于徳国Roche 公司，引物由南京金斯瑞公司合成。

1.3 方法

1.3.1 标本釆集与处理

采集ESCC 患者和健康体检者空腹静脉血4mL,迅速注入EDTA 采血管中，轻轻混匀，4℃ 3500×g 离心10min，取上淸液放入新的无RNA 酶EP 管中，放置-80℃冰箱中待用。

1.3.2 血浆中总RNA 的提取

取EP 管中的血浆标本250ul，加入750ul Trizol 裂解液，混匀后依次加入三氯甲烷、异丙醇等试剂，按说明书提取总RNA。总RNA 经NanoDrop ND-2000 分光光度计测定浓度

及纯度，并电泳检测RNA 完整性，质量合格后用DEPC 水溶解保存在-80℃，用于后续实验。

1.3.3 反转录反应

取2ulRNA 入EP 管中，用DEPC 水加至11ul，65 ℃放置5 min 后冰浴5 min 离心，加入5×Reaction buffer 4.0ul、dNTPs 2.0ul、Rnase Inhibitor1.0ul、RT 酶 1.0ul，离心后42℃孵育60min，70 ℃反应10 min 后立即取出冰浴冷却，合成cDNA，于-20℃保存。

1.3.4 实时荧光定量PCR 反应

合成cDNA 后，以Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）荧光定量PCR 试剂盒来扩增目的基因，U6 为内参基因，血浆miRNA 含量釆用相对表达量2-ΔΔct 表示。

1.4 统计学处理

采用GraphPad5.0 软件分析数据。多组间数据比较采用方差分析,两组间数据比较采用t检验，采用ROC 曲线分析miR-1O6b-3p 及miR-214 对ESCC 诊断价值，P＜0.05 表示有统计学差异。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者和健康体检者的血浆miR-106b-3p、miR-214 表达情况

在食管鳞癌患者术前的血浆中miR-106b-3p 及miR-214 表达量分别为（0.684±0.13）及（0.832±0.14），健康体检者的血浆中 miR-l06b-3p、miR-214 表达量分别为（0.21±0.03）及（0.28±0.05）,两者与健康组相比存在显著差异，具有统计学意义。

2.2 miR-106b-3p 及miR-214 的表达与临床病理特征之间的关系

通过对临床及病理资料的分析，发现食管鳞癌患者血浆miR-IO6b-3p 及miR-214 随着患者TNM 分期増加及淋巴结转移而明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）,而与患者年龄、性别无关(P＞0.05)。

2.3 血浆miR-1O6b-3p 和miR-214 诊断食管鳞癌的价值

经过ROC 曲线分析显示，术前血浆miR-1O6b-3p 相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.169，AUC 为0.833,敏感性为74.5%，特异性为82.6%。术前血浆miR-214 相对表达量诊断食管鳞癌的最佳临界值为≤0.169，AUC 为0.834,敏感性为76.2%，特异性为84.3%。

3 讨论

miRNAs 是调节人类表观遗传的重要分子之一，是一类长度大小约为20-22 个核苷酸左右的非编码小RNA，参与了人体几乎所有的生物学调节途径[5,6]。miRNAs 能够通过其碱基序列区域与其相应靶目标mRNA 的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）中的互补碱基序列进行完全或不完全的互补结合，在基因的转录后阶段调控其相应靶目标mRNA 的表达水平。在癌症中，miRNAs 既可作为致癌分子也可作为抑癌分子，通过调控其靶基因的表达水平从而对癌症细胞的增殖、凋亡和转移等产生影响。在人类miRNAs 中，约50%左右的miRNAs 所在的基因组区域与癌症之间存在密切的联系[7]。因此，癌组织中异常表达的miRNAs 对肿瘤的早期诊断、组织类型的分类及转移及预后等方面有着极其重要的价值[8]。

miR-106b 是miR-106b-25 家族中的一员，在多种肿瘤中异常高表达，具有调控肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖等重要的功能。李元梅等研究显示，miR-106b 在甲状腺癌组织中的表达水平显著低于相应癌旁组织，提示其在甲状腺癌的发生发展中发挥抑癌基因作用[9]；施莉等采用miRNA 表达芯片检测了3 例胃癌患者组织标本，结果示miR-106b 在发生淋巴结转移患者的胃癌组织最高[10]；韩东等研究显示食管鳞癌组织miR-106b 相对表达量高于癌旁正常组织[11]。然而迄今为止，关于miR-lO6b-3p 在ESCC 患者血浆中表达的研究尚未有报道。本实验结果显示ESCC 患者的血浆miR-106b-3p 表达水平明显高于健康者 (P＜0.01 )，且随着患者TNM 分期増加及淋巴结转移而明显上调，其诊断ESCC 的敏感性为74.5%，特异性为82.6%，和既往报道miR-1O6b 的情况相似[12]，说明miR-1O6b-3p 可作为一个新的肿瘤生物学标志，在临床上可通过检测血浆miR-l06b-3p 来协助ESCC 的诊断及预后判断。

miR-214 在不同肿瘤中的表达水平不同，可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤发生、发展、侵袭等过程中发挥作用[13]。目前，血液miR-214 已被证实可作为乳腺癌、膀胱癌等多种癌症的特异性标志物而在临床中应用[14]。Li 等[15]应用RTqPCR 检测98 例原发性肝癌患者和3 株肝癌细胞中miR-214-3p 的表达，结果表明，与正常肝组织相比，肝癌组织及复发肝癌组织中miR-214-3p 的表达下调，Yang 等[16]研究显示，miR-214 在胃癌组织及细胞中均升高。关于miR-214 在ESCC 中的表达，Wang 等[17]的研究显示其在ESCC 组织及细胞中的表达下降，认为miR-214 在ESCC 中为抑癌基因，而Q1AO 等[18]研究发现是致癌基因。关于ESCC 患者血浆miR-214 的表达情况，目前尚未见报道。本研究通过逆转录定量PCR 方法检测ESCC 患者及健康人群血浆miR-214 表达水平，发现ESCC 患者血浆miR-214 表达水平明显高于健康者(P＜0.01), miR-214 表达水平与ESCC 分期及淋巴结转移情况有关，ROC 曲线分析显示其可作为区分ESCC 与健康者的分子标志物，因此，临床上miR-214 可作为新的辅助诊断ESCC 的血液肿瘤标志物。

总之，上调的ESCC 血浆miR-1O6b-3p、miR-214 表达水平反映了ESCC 的进展情况，可作为新的肿瘤分子标志物及预后判断指标，对指导临床诊治具有一定的价值。