信号通路在软骨细胞肥大中的研究进展

蒙卫东，刘时璋

(1.西安医学院，陕西 西安 710068；2.陕西省人民医院骨科，陕西 西安 710068)

0 引言

骨关节炎(OA)是最常见的退行性关节疾病，影响一个或几个关节，包括小关节(如手部关节)和大关节(如膝关节和髋关节)[1]。OA是一项重大的公共卫生挑战。在全球范围内，2017年OA的年龄标准化点患病率和年发病率分别为3754.2/10万人和181.2/ 10万人，分别比1990年增加了9.3%和8.2%。虽然由于OA导致的患病率、发病率和残疾年数存在显著的国际差异，但大多数国家的负担正在增加，随着预期寿命的延长和全球人口的老龄化，预计OA的负担会越来越重[2]。

在基于细胞的软骨再生疗法中，间充质干细胞(MSCs)治疗引发了多项实验的设计，同时提供了有希望的初步疗效。实验表明，MSCs可以在体内和体外分化为软骨细胞(以SOX9、蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(Col2A1)为标志)。然而，在MSCs用于体内软骨修复的应用中，观察到向成骨谱系的肥大性分化。预防肥大对MSCs在软骨组织工程中的临床应用越来越重要[3]。而且，在软骨退变的过程中，健康的软骨细胞表型向肥大表型转变，这也是OA软骨的一个重要病理变化[4]。OA也出现软骨细胞增殖、软骨细胞肥大分化、细胞外基质重塑和矿化、血管浸润和软骨细胞凋亡死亡等现象。此外，转基因小鼠模型表明，关节软骨细胞的去调节肥大分化可能是骨关节炎发病和进展的驱动因素。因此，控制肥大分化可作为软骨修复的有效策略，并用于骨再生，其中肥大软骨可作为软骨内骨形成的模板。然而，肥大分化的确切分子机制尚不明确。尽管对肥大中单一信号通路的功能进行了大量研究，但对于探索MSCs和软骨细胞肥大分化中综合信号通路的研究很少。该文讨论了信号通路如何参与MSCs和软骨细胞的肥大，这些信号通路如何相互作用，以及信号因子如何在骨关节炎疾病中改变。

1 MSCs软骨分化过程中及OA进展过程中软骨细胞的肥大

MSCs是软骨组织工程的有前途的候选细胞，因为它们广泛存在于骨髓、脂肪组织、牙龈组织、脐带[5]、羊膜、绒毛膜、蜕膜[6]、滑膜和软骨[7]中，并且可以在不丧失软骨形成分化能力的情况下扩增多次。然而，软骨修复中MSCs的表型并不稳定。经历软骨形成的MSCs表达软骨肥大标记物(如X型胶原)，引起了对MSCs组织工程应用的关注，因为在新软骨中软骨细胞的肥大最终会导致细胞凋亡和骨化[8]。

虽然软骨细胞的肥大是骨骼生长和发育的一个短暂阶段。但也是OA软骨的一个重要病理变化，软骨细胞失去了稳定的表型，并检测到RUNX2、X型胶原(ColX)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、Indian hedgehog (IHH)和碱性磷酸酶(ALP)的表达。健康的关节软骨是一种稳定的组织，具有通过未知机制抵抗肥大分化和维持正常表型的潜力。多种信号通路的相互作用调节软骨细胞的命运，即保留在软骨内或经历肥大分化[4]。

2 肥大的信号通路

在MSCs和软骨细胞的软骨形成中，多种信号通路参与了肥大样变化的调节。根据最近的文献，最重要的是WNT、骨形态发生蛋白(BMP)/转化生长因子β(TGFβ)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)、Indian Hedgehog (IHH)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、HIPPO、AMP依赖蛋白激酶(AMPK)和缺氧诱导因子(HIF)等信号通路。

2.1 WNT信号通路

WNT信号通路是进化中高度保守的通路，在胚胎发育、人体结构、组织稳态、生长以及多种疾病的发病和进展中具有关键作用。它控制着肢体发育期间生长板中软骨细胞肥大和软骨内骨化。它由一个复杂的途径网络组成，包括典型的WNT/β-catenin信号通路，以及独立于β-连环蛋白的非典型途径：JNK信号通路和WNT/Ca2+信号通路[8]。典型的WNT/β-catenin途径是研究最多的通路，由核内β-catenin积聚介导，与软骨细胞肥大密切相关。在大多数情况下，与WNT受体Frizzled结合的WNTs的存在导致大肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β (GSK3β)和轴抑制剂(AXIN)的形成复合物，从而导致β-catenin从复合物中释放，随后β-catenin在细胞质中积累，然后转移到细胞核中[9]。β-catenin与T细胞特异性因子(TCF)/淋巴增强子结合蛋白(LEF)转录因子形成复合物，激活靶基因的转录。然而，在缺乏WNT配体的情况下，β-catenin被破坏复合物磷酸化，随后泛素化并靶向蛋白酶体降解。

大量研究揭示了WNT信号在软骨稳态中的核心作用。在软骨中，适度的WNT活性对于软骨细胞增殖和维持其典型特征是必不可少的，但是过度的活性会增加软骨细胞肥大和软骨降解金属蛋白酶的表达。例如，成年小鼠关节软骨细胞中β-catenin基因的条件性激活导致软骨细胞过早分化发展为X型胶原表达和骨关节炎样表型[10]。SOX9转录因子是软骨细胞的典型标志，而RUNX2通常在肥大的软骨细胞中高表达[3]。许多研究表明，SOX9和RUNX2表达之间的转换决定了成熟软骨细胞通过典型WNT信号而向肥大表型发展。

有几种类型的WNT配体，它们在软骨形成分化和软骨发育中发挥不同的作用。使用逆转录病毒体内错表达和体外过表达方法的实验表明，不同WNTs在控制软骨形成分化和肥大中具有不同的作用。WNT3a和WNT5b促进软骨分化，但延迟肥大[11,12]。软骨分化过程中WNT5a、WNT11在骨髓间充质干细胞中的过度表达促进软骨肥大，并促进BMP和IHH表达[8]。WNT16通过非典型WNT通路激活PCP/JNK和mTORC1-PTHrP通路来抑制软骨细胞肥大。

在Dickkopf (DKK1)的存在下，MSCs软骨形成中肥大相关标记物的表达减少，DKK1通过软骨保护机制与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP5/6)结合，充当WNT信号抑制剂。实际上，WNT通路拮抗剂Dkk1和卷曲相关蛋白(FRZB)是阻断MSCs肥大分化的关键因素。首先，Dkk1和FRZB是MSCs向软骨分化的初始阶段所必需的，其次是软骨细胞再分化所必需的，最后是阻止关节软骨细胞肥大分化所必需的[13]。研究还发现，在MSCs软骨形成过程中，在缺乏WNT抑制剂DKK1和FRZB的情况下，肥大分化和矿化增加，软骨细胞标记物表达减少。在MSCs颗粒培养中，DKK1和FRZB对典型WNT的抑制增加了Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达，但不影响X型胶原的表达[14]。

2.2 转化生长因子β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)信号通路

TGF-β超家族包括多组多功能蛋白，形成两大亚家族，即TGF-β亚家族和BMP亚家族。对这两个亚家族分别通过典型的(分别为Smad2/3和Smad1/5/8)和非典型的信号通路激活，在不同的环境条件和细胞类型下是不同的。近年来的大量研究数据表明，这两个亚家族之间的相互作用在许多细胞过程中发挥着核心作用，这些过程包括调节细胞增殖和分化，以及转导不同组织和器官的发育和维持的信号级联反应[15]。

TGF-β可在体外诱导软骨形成，通过TGF-β/Cdc42/Pak/Akt/Sox9信号通路促进成软骨细胞分化[16]。同时，在BMCs软骨形成过程中，通过TGF-β/Smad1信号通路促进软骨形成，抑制软骨细胞肥大[17]。尽管TGF-β在抑制BMCs软骨细胞肥大方面显然至关重要，但在MSCs的培养过程中将其加入软骨细胞分化培养基不足以抑制肥大表型的发生。

BMP信号主要通过软骨细胞中典型的BMP/Smad途径介导。当BMP结合受体BMPR时，该通路将被激活，这些受体磷酸化Sma和Mad相关蛋白Smad1、Smad5和Smad8。R-Smads与Smad4形成复合物，并转移到细胞核中，在那里它们与靶基因的调节区结合以调节它们的表达。BMP在胚胎骨骼发育过程中有多种作用，除了MSCs的间充质浓缩和软骨形成分化外，BMP还诱导早期软骨形成，是软骨细胞增殖和软骨内骨化成熟的关键局部因素[18]。虽然BMP对关节软骨有保护作用，但它们也参与软骨细胞肥大和基质降解。有研究筛选了两种BMP I型受体激酶抑制剂，研究它们对hMSC软骨形成的时间和剂量依赖效应，受试抑制剂不同的受体选择性表明，暂时阻断ALK2和ALK3受体，虽然可调节hMSC形成软骨，但对于维持稳定的软骨细胞表型是必要的[19]。BMP2、BMP 4、BMP 7、BMP9选择性地诱导ColX的表达，它被认为是细胞肥大的早期标志[8,20-22]。而BMP7诱导大鼠OA模型中肥大前期软骨细胞向肥大表型方向分化[23]。体内研究表明，BMP4在转基因小鼠软骨中的过度表达导致肥大区增加，表明肥大软骨细胞的分化增加。由于BMP也在骨骼发育中发挥作用，因此BMP可能在骨化后驱动软骨细胞形成骨骼，而不是作为关节软骨细胞保留下来[18]。因此，BMP可以保护关节软骨，但可能通过诱导软骨细胞终末分化和促进骨关节炎的进展而对关节软骨产生有害影响。之前的研究表明，BMP抑制剂Noggin可以通过抑制MSCs软骨形成过程中的BMP4来阻断甲状腺诱导的肥大[21]，同时，一种BMPR1A/ACVR1特异性靶向抑制剂LDN193189，可通过抑制小鼠OA模型中的肥大和MMP-13来抑制软骨退化[24]。Pfeifer等认为，MSCs通过生长板软骨细胞途径向软骨细胞分化中，肥大表型改变是促肥厚性BMP信号的激活和抗肥厚性TGF信号的减少共同作用的结果[25]。

2.3 甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和Indian Hedgehog (IHH)信号通路

PTHrP是甲状旁腺激素(PTH)家族的一员，通过刺激NK3同源盒2和抑制RUNX2表达来阻断肥大[26]。IHH是软骨细胞分化和软骨内成骨所必需的，在PTHrP在负反馈环中作用，调节软骨细胞早期分化和进入肥大分化[27]。在特异性缺失IHH基因敲除小鼠的OA模型中，仅观察到轻微的OA改变，而对照组小鼠表现出明显的软骨损伤[28]。在软骨内成骨过程中，随着血清甲状腺激素(TH)水平的升高，骨骺中表达SOX9和COL2的未成熟软骨细胞在出生后7-10天转变为肥大前期的软骨细胞，最后转化为表达COL1和BSP的成骨细胞，TH通过激活TRβ1来增加IHH的表达，IHH促进软骨细胞肥大[29]。IHH和PTHrP信号在调节软骨细胞肥大的发生中起着至关重要的作用。Erickson等人发现，IHH刺激增殖的软骨细胞产生PTHrP，进而加速关节周围细胞的增殖，防止软骨细胞肥大，从而使软骨细胞保持增殖状态。这种负反馈回路调节软骨细胞增殖和成熟之间的平衡，确保有序的骨形成。另一方面，与体内观察结果一致，外源性PTHrP刺激细胞增殖，抑制细胞肥大，而IHH信号则刺激软骨细胞肥大[26]。PTHrP可抑制心肌细胞增强因子2(MEF2)的作用，而MEF2作用于软骨细胞肥大所需的Runx2的表达。PTHrP通过允许HDAC4和HDAC5阻断MEF2/Runx2信号级联来抑制体内软骨细胞肥大和随后的骨形成[30]。同时，有研究发现IHH诱导软骨细胞中Runx2的表达，而不上调其他软骨细胞成熟调节因子，如MEF2C、Foxa2和Foxa3。Runx2与IHH协同促进COL10α1的表达。且IHH可以通过下游转录因子Gli 1/2的Runx2/Smad相互作用调节X型胶原的转录和表达[27]。在MSCs颗粒研究中也观察到了类似的现象，表明PTHrP治疗可抑制肥大，从软骨分化的早期给予PTHrP，MSCs分化过程中的肥大标志物较少，软骨细胞质量较好[31]。

2.4 其他信号通路

FGF信号在控制软骨细胞分化中起着关键作用。其中，FGF2参与细胞增殖和软骨形成过程的启动； FGF9及FGF18通过提前改变软骨形成程序刺激早期软骨分化且增加细胞外基质的产生，以及延迟MSCs软骨形成中的终末肥大[32]。IGF-1已被确定为骨骼发育的重要生长因子。IGF-1通过1型IGF-1受体(IGF1R)传递信号，IGF1R在生长板的增殖和高营养区前软骨细胞中表达[33]。转导TGFB1基因可诱导原代培养的MSCs向软骨细胞分化，降低软骨细胞肥大程度[34]。健康的关节软骨是典型的无血管组织，软骨细胞能够在低氧环境中存活。低氧被认为是对健康软骨细胞表型和软骨基质形成的积极影响。通过从MSCs海藻酸盐水凝胶中释放Dmog，可以稳定HIF-1α并增强其核定位，从而促进MSCs的软骨生成，并抑制了与软骨细胞肥大相关的标志物[35]。在大鼠OA模型中，CHM-1抑制HIF-2α核转位，降低HIF-2α在胶原Ⅹα1、血管内皮生长因子A和MMP-13上的转录活性，缓解OA发展进程[36]。YAP1是Hippo信号通路的下游基因，控制细胞的增殖和分化，可抑制ATDC5细胞的肥大分化[37]。此外，AMPK激动剂可靶向AMPK/PI3K/AKT信号通路，减少关节软骨细胞的肥大和纤维化分化，维持软骨细胞的成软骨表型[38]。

3 信号通路在调节肥大中的相互作用

在一项非典型WNT5A以及WNT11和LEF1对MSC的软骨形成和软骨细胞的再分化的研究中。小分子IWP-2抑制WNT可通过蛋白多糖沉积增加支持MSC的软骨形成，减少软骨内分化过程中观察到的BMP4、BMP7及其靶ID1、IHH及其靶GLI1的特征性上调。与促肥大转录因子MEF2C一起，IWP-2还降低了包括IBSP和碱性磷酸酶活性在内的多个肥大下游靶基因的活性，表明WNT活性促使BMP和IHH表达上调，并导致MSC肥大[8]。只有BMP2，而不是BMP-4，可以驱动低密度脂蛋白受体5(LRP5)的表达，这是WNT信号传导的最重要的共受体之一，导致β-catenin的稳定、积累、核易位和靶基因的激活。可以得出结论，BMP-2通过LRP-5诱导的WNT/β-连环蛋白信号通路激活诱导软骨细胞分解代谢作用和肥大[39]。WNT16通过激活PTHrP通路抑制软骨细胞肥大[40]。体外研究表明，FGF2与PTHrP结合抑制TGFβ导致的COL2A1和COL10A1的表达和ALPL诱导[41]。此外，Wnt通路可通过抑制PTHrP信号活性来促进软骨细胞肥大。因此，PTHrP抑制肥大软骨分化，而WNT和IHH促进软骨细胞肥大。因此，信号通路间的良好平衡是软骨细胞正常表型的要求。此外，TGFβ-1通过HIPPO信号途径降低肥大标志物基因表达，从而抑制软骨细胞肥大[42]。

4 结论

软骨细胞分化受多种信号通路的调节，维持正常的软骨细胞表型和避免肥大化对软骨修复很重要。SOX9和RUNX2是软骨细胞发育的两个典型标志。SOX9在软骨细胞中表达，而RUNX2在肥大软骨细胞中高表达。在大多数情况下，肥大表型伴随着通过激活WNT、BMP、IHH、FGF和HIF信号通路中的任一个而高表达RUNX2。同时，TGFβ、IGF-1和PTHrP能促进软骨细胞的增殖。但是，正常软骨细胞保持着低代谢状态，随着对代谢相关信号通路如AMPK的深入研究，细胞代谢以及离子水平的改变，也促进了软骨细胞肥大。这些信号通路的平衡通过SOX9和RUNX2转录活性之间的转移来调节软骨细胞增殖或肥大的状态，它们之间的良好平衡是正常软骨细胞分化和软骨发育需具有的条件。