抗菌肽在口腔领域中的研究进展

陈春营，韩丽娟

(1.右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院口腔科，广西 百色 533000)

0 引言

龋齿和牙周病被认为是人类最普遍的细菌感染疾病，这类口腔病变的主要病因是口腔表面病原微生物的定植，即生物膜的形成。生物膜是指微生物粘附于生命或非生命的介质表面，并被其自身分泌的胞外基质包裹而形成的一种稳定复杂的三维网状结构[1]。与浮游细菌相比，获得了对传统抗生素和宿主免疫反应高度耐受的特性，用抗生素治疗很难将其彻底杀灭或者清除，且加大抗生素的用量不仅对生物膜内的细菌无效，还可能引起无法预知的毒副作用[2]。因此，近年来，对抑制浮游微生物生长和/或浮游微生物发展成生物膜的新分子的研究一直在加强。在此背景下，抗菌肽(antimicrobial peptides, Amps)已成为口腔微生物学领域的研究热点。AMPs是由无脊椎动物、植物和动物的各种组织和细胞系产生的一组异构分子。作为多细胞生物固有免疫反应的组成部分，对细菌、真菌、原生动物、病毒具有广泛的抗菌活性，对癌细胞具有细胞毒活性。这些分子由于其浓度低、选择性抗菌活性低以及微生物耐药性诱导率低，已被证明是控制微生物生长的有前途的药剂。

本文首先简要介绍了AMPs分类特点，然后系统阐述了AMPs的抗菌机制和人工合成物的最新进展和临床应用，并展望了该领域的发展前景。

1 AMPs的基本结构

AMPs是一种天然抗菌分子，它从原核生物(如细菌)和真核生物(如原生动物、真菌、植物、昆虫和动物)中分离出来，被认为是生物体内天然防御的多功能效应器。在人体中抗菌肽可以在很多组织中表达，包括皮肤上皮细胞、呼吸系统、消化系统甚至是免疫系统中。AMPs通常是10到50个氨基酸残基组成，由于赖氨酸和精氨酸残基的丰富，它们具有正的电荷范围从+2到+9，这对与负电荷的静电相互作用至关重要。由于二硫键桥的存在或与膜的接触，它们采用三维两亲结构[3]，带正电的亲水结构域与疏水结构域能很好地分离，这种组合非常适合与膜相互作用，特别是细菌膜与其带负电荷的亲水基团和疏水核心。由于阳离子氨基酸残基在许多抗菌肽中含量丰富，因此常也称为阳离子宿主防御肽或阳离子抗菌肽。

2 AMPs的分类和作用机制

2.1 AMPs的分类

AMPs根据来源可分为昆虫、其他动物、合成微生物和基因工程微生物。根据二级结构分为α-螺旋肽、β-薄片肽、扩展肽和环肽四类。大多数AMPs属于前两类。其中，α-螺旋肽是目前研究最多的AMPs。α-螺旋型和β-薄片型AMPs是通过破坏细菌膜发挥抗菌活性。β链型聚脯氨酸或环状螺旋，如Nisin和PR-39，在蛋白质水解方面较稳定[4]。许多扩张型AMPs对病原体的细胞膜没有活性，它们是通过穿透细胞膜和与细胞内靶标相互作用来实现抗菌活性。

2.2 AMPs的抗菌机制

无论细胞的代谢阶段如何，膜的完整性对于细菌的生存都是至关重要的。大多数AMPs以微生物的膜完整性为目标，通过裂解导致细胞死亡。AMPs的典型特征是与膜相互作用的能力，其特点是膜渗透。这些多肽被显著的亲水带正电荷的结构域促进，与带负电荷的微生物表面相互作用，以及双分子层磷脂的头部基团导致细胞膜穿透。因此，跨膜电位和pH梯度被破坏，渗透调节受到影响。传统阳离子AMPs通过静电作用与革兰氏阴性菌外膜结合，并通过“桶壁”“环孔”或“地毯”孔机制通过膜的不稳定穿过革兰氏阴性菌外膜，破坏细胞质膜的物理完整性。还有观点认为AMPs抑制大分子合成(蛋白质、DNA和RNA)或靶向代谢酶[5]来杀死细胞。目前，AMPs的作用机制尚不完全清楚。然而，一些关于这些分子如何作用于细胞膜和细菌代谢的理论已经被提出，以氨基酸的理化特性和分子机制为基础[6]的抗菌机制主要包括以下4种：(1)桶壁模型：肽足够长，可以垂直穿透膜，并在脂质双分子层上形成一个桶形孔，允许细胞内的物质流出到细胞外环境。(2)地毯模型：在这个模型中，AMPs以一种类似洗涤剂的方式作用，覆盖细胞表面，直到达到阈值浓度，导致膜斑块的形成，其中脂类形成由两亲肽稳定的环状聚集物。因此，细胞膜发生剧烈破坏，导致细胞死亡[7]。(3)环孔模型：肽与膜的初始结合之后是进入的单体单元的级联聚集，导致外膜和内膜的脂质部分向内折叠，形成一个由多个肽单元排列的连续通道[8]，允许流体外流到外部环境。(4)细胞内靶向机制：除了与细胞膜相互作用的能力外，越来越多的证据表明AMPs具有其他的细胞内靶点。它们可以有多个细胞内目标——它们可以结合DNA、RNA和蛋白质，抑制细胞壁合成，以及DNA、RNA或蛋白质合成。此外，在体外或体内，多肽可通过几种类型的AMPs引起的细胞成丝而干扰细菌的胞质分裂。它们有独特的转运机制，以改变细胞质膜隔膜[7]的形成，抑制细胞壁合成，抑制核酸合成，抑制蛋白质合成或抑制酶活性，如Drosocin, pyrrhocoricin和apidecin等。虽然膜损伤模型不同，但它们大多是相互关联的。这种复杂的、通常是多模态的抗菌作用使微生物更难形成持久的耐药机制，这提供了抗菌肽相对于传统抗生素的另一个显著优势。

3 AMPs及其合成产物的临床应用

由于生产成本高，AMPs作为原料药的发展受到很大限制。多肽的化学合成虽然效率高，但也非常复杂和昂贵。因此，越来越多的具有各种性质的新型AMPs通过基因工程正在被发现或合成。

3.1 治疗创口感染

大多数抗菌肽具有显著的杀菌功能，用于炎症和免疫细胞的募集、激活、成熟和组织修复。皮肤和软组织感染是人类最常见的微生物感染之一，AMPs由于其对多种微生物具有杀菌活性(包括白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)，渗透血液的能力较低，在局部给药的靶部位具有高浓度的优势。Zhu等[9]以乙二醇壳聚糖和醛改性聚乙二醇为基础制备了一种含粘菌素的水凝胶，利用体内小鼠烧伤感染模型实验证明，释放的粘菌素成功治愈了粘菌素敏感和耐药铜绿假单胞菌引起的慢性伤口感染。hBD2是由表皮生长因子受体激活诱导的，它可以增加角质形成细胞的迁移和细胞因子的产生[10]。LL-37肽在创伤后表达也增加[11]，有促炎和抗炎活性，能促进趋化、血管生成。由于皮肤，口腔微生物群不仅包括细菌种类，还包括病毒、真菌，与传统抗生素相比，这种广谱抗菌肽抗炎效果更好。在创面，AMPs不仅可以防止病原菌在创面皮肤中的增殖和生物膜的形成，还可以通过调节细胞迁移、趋化、细胞因子释放和血管生成来促进创面愈合[12]。因此，AMPs在治疗牙龈炎、牙周炎、鹅口疮、皮肤感染性和非感染性伤口方面有较大潜力。

3.2 防龋和治疗牙周炎

AMPs能有效地破坏早期牙菌斑生物膜的形成，在龋病防治领域可提供新的思路。刘奕[13]等发现十肽对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌等都有较强的抑菌杀菌作用，且当十肽的浓度增加到1 g·L-1的高浓度时也不会导致人牙龈成纤维细胞死亡，仍能使细胞膜保持较完整的结构。何佳宁[14]等发现经KR-1、KR-2处理后的变异链球菌生物膜变得不完整和疏松，有利于后续的机械清除。GH12和ZXR-2不仅可抑制口腔链球菌的活性，还可抑制细菌致龋性以及改变多种生物膜组成[15]；TVH19不仅有抗菌的作用，还兼具有促进再矿化的能力[16]；Nal-P-113[17]对口腔病原体及其生物膜具有良好的清除能力，可以抑制和杀死浮游状态的牙周病优势菌(如牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚集杆菌)抗菌作用比青霉素和甲硝唑更快、更强。

人工合成的AMPs在有效浓度内具有较好的生物相容性，抗生物膜特性，对多种口腔致病菌具有快速、高效的抑制及杀灭作用；由此研究结果推测，通过口内局部用药，短时间的药物接触后能持续抑制口腔变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌等致病菌生长，维持口腔菌群平衡，达到防龋和治疗牙周炎目的。

3.3 抗肿瘤作用

虽然AMPs的研究主要集中在抗菌特性上，但越来越多的证据表明，AMPs具有抗肿瘤功能。目前已经提出了三种机制，即：(1)细胞膜的溶解；(2)外部凋亡途径的激活；(3)抑制血管生成。有些AMPs特异性靶向肿瘤或癌细胞，通过转化细胞破坏正常哺乳动物细胞膜的不对称性[18]，这种不对称性的变化通常是凋亡细胞和几种类型的癌细胞所共有的，有利于单核细胞识别和清除这些细胞。此外，AMPs还能够内化细胞，与线粒体等细胞内隔间相互作用，诱导细胞凋亡[19]。TX-315溶瘤特性不仅杀死癌细胞，也改变肿瘤微环境，减少免疫抑制肿瘤和髓系抑制细胞和多功能增加频率T辅助型细胞毒性[20]。nisin能在体外抑制头颈部鳞状细胞癌的生长，诱导细胞凋亡和细胞周期抑制，同时降低细胞增殖[21]。LL-37在不同细胞和组织中的失调[22]似乎有助于促进癌症和增加肿瘤发生。迄今为止，人类合成的抗菌肽α-和β-防御素是研究最多的防御素。α-防御素的抗肿瘤活性，特别是人类中性粒细胞肽的抗肿瘤活性，已经通过膜溶解和凋亡机制以及抑制肿瘤生长所需的新生血管得到证实。然而，与大多数抗癌药物一样，AMPs也会杀死正常细胞，如成纤维细胞、上皮细胞和白细胞，对肿瘤细胞也缺乏选择性。

AMPs的抗癌特性可以阻断病毒的附着和进入，在宿主细胞内的生长和复制，引起多细胞生物的程序性细胞死亡。AMPs有潜力成为唯一一类可用于治疗多重微生物联合感染和癌症的药物，但是目前许多AMPs的抗癌机制尚不清楚，AMPs的抗肿瘤活性和抗肿瘤特异性的限制仍需通过肽工程的重组表达去解决。

4 安全性评价

一些研究报道了抗菌肽与其他常规或非常规药物联合使用的潜力。这种协同组合可以帮助提高效力，同时减少治疗剂量、副作用和耐药性的威胁。如链霉素、复方新诺明联合CM11肽对马利斯特布鲁氏菌耐药菌株有协同作用[23]。安全性方面，许多体内研究表明，在低APMs的实验室小鼠中几乎没有毒性。但是，当AMPs因作为耐药微生物引起的感染的替代或补充治疗的潜力开发用于临床目的时，因生产成本高、生产过程复杂、酶降解的不稳定性、可能与血清蛋白相互作用而导致循环半衰期缩短[9]，以及不可预测的毒性，使APMs的治疗应用仍然受到限制。广泛的结构-功能研究是必要的，以确定最佳抗菌膜效果所需的最小结构特征，也还需要反复进行动物模型实验，确定其的最佳给药剂型、给药途径和给药剂量。

5 研究展望

随着抗生素耐药菌株的产生和抗生素日益高昂的费用使得研发新型抗生素迫在眉睫，目前，抗菌肽是抗微生物耐药最具前景的方法之一。这一点在越来越多的涉及这些肽的研究中得到了证实。APMs外用凝胶、水凝胶、外用乳膏、手术部位给药的透明质酸基水凝胶、口服液和漱口水等已应用于临床。随着技术的发展，更多的APMs可能在不久的将来进入临床试验，如用于种植体表面的抗菌肽涂层、改善皮肤状态的化妆品、防龋的抗菌肽凝胶、开发成人类或其他动物的疫苗、医疗设备消毒剂和食品防腐剂等。虽然天然或合成的APMs尚未取代市场上最有效的抗生素，但在APMs研究领域已经取得了显著进展，尤其是在鉴定新肽序列、评估其抗感染的潜力方面[25]。总的来说，随着寻求解决方案，改善APMs设计和肽生产技术的新进展，APMs将开启其发展的新时代。