鼠趾再生过程中的相关分子机制研究进展

王启文，刘英芹

(桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541199)

0 引言

哺乳动物通常被认为是再生潜力较差的有机体，但是有少数哺乳动物显示出强大的再生能力[1]。哺乳动物的再生仅限于第三趾骨的远端(P3)[2-4]，与其它长骨相比，第二趾骨(P2)截肢导致骨截断和皮肤愈合与纤维瘢痕形成。最近的研究表明，尽管P2没有再生反应，但P2截肢启动了类似于骨折愈合的动态修复反应，并显示出软组织再生的迹象[5]。体外研究显示新生胎儿和小鼠指尖存在解剖学和分子学的相似性[1]，另外，指尖是人体肢体中唯一具有再生能力的部分，因此鼠趾趾尖已成为研究临床相关再生反应的模型[6]。首先，鼠趾趾尖再生是一个复杂的过程，并且通过连续阶段进行，包括炎症发生，组织溶解，表皮闭合，胚芽形成和分化等阶段[6]。同时，再生也是由一个涉及许多生长因子的复杂信号传导通路来调节的过程，细胞间信号传导对再生的诱导和促进至关重要。脊椎动物的四肢通过许多生长因子及其信号通路的相互协调而生长，包括Wnt通路，FGF、BMP、SMAD通路和TGF-β途径[4,9-11]。这些研究证实，许多基因和细胞因子及其信号通路对鼠趾再生有促进或抑制作用。

2 不同基因和细胞因子对鼠趾再生的影响

鼠趾再生过程中会有多种基因和细胞因子的参与，比如BMP、FGF4、Msx1、Msx2、Sox2、Hoxc13、Ihh、SIRT3和血管内皮生长因子等。胚胎鼠趾再生期间，在发育鼠趾的趾尖特异性表达的许多基因被上调，表明这些基因对再生反应产生了重要作用[1]。本文重点阐述BMP2、BMP4、BMP9、FGF4、SIRT3和α-MSH以及Msx、Sox2对鼠趾形态的发育和影响。

2.1 BMP在鼠趾再生中的作用

BMP是一类结构相似的高度保守的功能蛋白，属于TGF-β家族。BMP可以诱导DNA合成和细胞复制，从而促进间充质细胞分化为成骨细胞。它也是诱导骨和软骨发育的主要因子，在四肢生长、早期骨折、软骨修复中表达，在胚胎发育和骨再生过程中起重要作用。

先前关于胎儿和新生儿鼠趾截肢的研究表明BMP信号通路在再生中起关键的调控作用[12]。从指甲近端褶皱(nail proximal fold，NPF)中分离出的指甲缓慢循环标记滞留细胞(label-retaining cells,LRCs)的基因表达谱显示，两种BMP信号通路的抑制剂被下调，从而表明BMP通路在指甲稳态中的作用[13]。再生的特征在于未分化增殖细胞的芽基形成并表达BMP4[2]，原位杂交结果表明，再生过程中BMP4的表达上调，因此，表明其在再生反应中诱导发育[2]；同时，在新生小鼠的断趾模型研究中发现，BMP拮抗剂头蛋白治疗抑制了再生，因此表明BMP可以促进鼠趾断趾再生。另外，利用非再生截肢伤口表明，BMP2或者BMP7(BMP7也会诱导骨骼生长[14])能诱导鼠趾再生反应[12]。研究还发现当Msx1突变小鼠表现出再生缺陷时，可以通过外源性BMP4处理来解决，并且用BMP拮抗剂头蛋白处理野生型鼠趾截肢抑制了再生[12]。再生还与水平有关，截断第三趾骨(P3)远端区域后可再生，而更近端水平的截肢则无法再生[2]。在新生儿鼠趾的研究中，成功的再生同样需要BMP信号传导并且通过BMP2或BMP7的靶向治疗来刺激近端(非再生)损伤截肢再生[2]。BMP2通过建立一个在肥厚性软骨细胞附近有增殖的软骨内骨化中心来诱导P3的再生，但通过建立远端增殖软骨细胞的软骨内骨化中心诱导远端P2的再生；BMP2诱导的再生与局部增殖反应和已建立的鼠趾细胞标记基因的瞬时表达相关[12,15]。相关研究还表明，Bmp4在再生鼠趾胚芽间充质中表达。并受Msx1和Msx2的调节，这提高了BMP4可能是Msx1突变体鼠趾再生中限制因子的可能性[16]。BMP4表达的空间和时间模式研究表明它是建立几种不同器官系统所需的诱导组织相互作用的介质，包括心脏，脑垂体和肠道以及四肢。BMP4能以自分泌方式起作用来影响神经组织的增殖和/或分化；或者BMP4也能以旁分泌的方式起作用，来影响相邻细胞的生长和分化。这些结果都增加了BMP4是多肽信号分子、同源盒和视黄酸受体级联一部分的可能性，这些基因也都参与肢体的生长和发育。相关研究还表明BMP4在Msx1下游以剂量依赖性方式起作用，因此BMP4对再生反应的调节是非常必不可少的[16]。

BMP9可抑制鼠趾再生。BMP9是一个在出生后调节血管结构的有效因子[17,18]，并在不同的研究中被证明可以促进血管的生成或抑制血管的生成[19,20]。虽然在鼠趾再生过程中没有检测到BMP9转录，但用BMP9(500ng/μL)治疗被切除的鼠趾会导致完全的抑制再生。对BMP9组鼠趾的分析表明，在14DPI下分析的样本鼠趾中有100%显示出基于总检查的抑制再生反应；与BSA对照组相比，BMP9组鼠趾的骨体积分析导致最终P3体积显著减少。BMP9组鼠骨量与VEGF组鼠骨量基本相当[20]。在转染间充质祖细胞的研究中表明，BMP9在体内起到促进成骨细胞分化并且在体外起到促进异位骨形成的作用[21]。与BMP2一样，BMP9在内皮细胞的研究中已被证明通过标准的SMAD通路发出信号，而BMP9已被证明可以在其他细胞类型中激活替代的(非典型的)通路[22]。因此，BMP9对鼠趾再生的抑制影响突出了BMP信号传导的一个新方面，是抑制而非促进[20]。这些发现突出了BMP9活性的多样性。

综上所述，BMP在鼠趾再生中发挥着作用的生物学功能。

2.2 FGF4对小鼠肢体分叉反应的影响

分叉反应是鼠趾特定的，限于鼠趾IV；细胞标记研究表明，分叉反应是由鼠趾雏形的前软骨细胞在趾尖的重组引起的。FGF4对鼠趾形态发育的影响与许多基因(包括Msx1,IGF2和HoxD簇的后部成员)的表达变化密切相关[23]。

脊椎动物肢体骨骼的元素起源于间充质凝结，其在上皮-间充质相互作用后出现。这种相互作用包括位于早期肢芽远端趾尖的特殊上皮和下面的间充质之间的信号传导[24]。顶端外胚层脊(apical ectode rmalridge,AER)通过将间充质细胞维持在高度增殖和未分化状态来刺激肢体向外生长。极化活动区(zone of polarizing activity；ZPA)是肢体后壁和体壁附近的一小块中胚层组织，调节ZPA活性的因素包括同源框转录因子HoxD家族的成员和分泌的分子如音猬因子(SHH)和BMP2和BMP4。近端-远端肢体向外生长由表达成纤维细胞生长因子成员的FGF家族控制；其中FGF2和FGF8在整个AER中都有表达，而FGF4的表达仅限于后部AER；目前的研究表明这些FGF对AER和间充质之间的信号传导起重要作用[23,25]。FGF4在体外对早期小鼠肢芽细胞具有促进有丝分裂的作用[25]，并且在体内对于小鸡肢体的叉指细胞具有促进有丝分裂作用[23]。研究还发现FGF4抑制小鼠趾尖细胞的凋亡和Msx1，HoxD以及IGF2基因的表达[23]，这表明内源性FGF4在鼠指骨骼的远端生长中起重要作用。另外，研究提出了一种模型，其中FGF4在鼠趾IV的骨架分支期间将起双重作用。首先，FGF4将对间充质细胞具有直接的趋化作用，导致前软骨形成结构域的扩大；其次，FGF4将在建立外胚层信号中心中发挥作用。总之，FGF4在鼠指IV分叉反应中起双重作用。综上所述，FGF4在小鼠骨骼分支形态发育中是重要的内源性信号。

2.3 线粒体去乙酰化酶3(SIRT3)对鼠趾再生的影响

线粒体去乙酰化酶3(SIRT3)被认为是调节代谢的主要因素之一——促进线粒体能量的产生和维持稳态[26]。当SIRT3缺乏可降低鼠趾骨膜成骨细胞的氧化和糖酵解能力。当敲除小鼠中SIRT3会导致骨量减少，这可能是由于破骨细胞数量的增加[27]直接与ROS有关[28]；这将导致骨小梁数量减少，并降低机械能力[28]。缺乏SIRT3的小鼠由于成骨细胞数量的增加而出现严重的骨质减少。SIRT3通过干扰RANKL诱导的PGC-1β表达来抑制分化[27]。SIRT3-/-破骨细胞前体细胞通过下调AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)的表达来降低AMPK的磷酸化。研究也发现，SIRT3是RANKL介导的破骨细胞发育的内在抑制剂[27,29]。SIRT3通过对呼吸链的影响，参与了线粒体ATP产生机制的控制，研究中发现SIRT3-/-破骨前体细胞增加了破骨细胞的分化水平，并确实发现SIRT3缺陷小鼠由于破骨细胞数量的增加而显示出骨量减少[27]；SIRT3在RANKL诱导的破骨细胞分化期间由PGC-1β和ERRα诱导，并通过稳定AMPK蛋白可能作为破骨细胞发育的负性调节介质，因此表明SIRT3在破骨细胞形成中发挥了重要的分子刹车作用。SIRT3对破骨细胞的分化呈负调控，SIRT3的缺乏增强了破骨细胞的形成，另外需要注意的是SIRT3负调控破骨细胞分化，但不调控其功能，SIRT3的缺失没有导致破骨细胞前体细胞线粒体的任何缺陷[27]。另外，SIRT3调节的线粒体应激参与成骨细胞分化和骨形成[28]。在分化过程中，特异性诱导SOD2消除过量的线粒体超氧化物和蛋白质氧化，而SIRT3的表达通过K68的去乙酰化来增强SOD2的活性。SOD2和SIRT3的敲除都抑制了分化。同时，缺乏SIRT3的小鼠表现出明显的骨量减少，并伴有成骨细胞的功能障碍，而SOD2或SIRT3的过表达提高了来自SIRT3缺陷小鼠的原发性成骨细胞的分化能力。这都表明，SIRT3/SOD2是调节线粒体应激所必需的，并在成骨细胞分化和骨形成中发挥着重要的作用[28]。目前，对SIRT3/SOD2在骨形成和稳态方面的研究相当有限；SIRT3抑制了RANKL介导的破骨细胞发育[28]，SIRT3的缺失导致MTROS增加而损害线粒体稳态和功能，从而抑制体外和体内的骨发育，因此SIRT3/SOD2可能是促进骨骼的潜在靶点[28]。作为线粒体内重要的去乙酰化酶，SIRT3被认为是基础ATP和整体能量稳态的重要调节剂，它也被证明主要通过赖氨酸68(K68)去乙酰酸并以此来激活SOD2[28]。这些数据进一步支持了SIRT3/SOD2轴在调节成骨细胞功能和骨形成中的重要作用。

综上所述，这些研究表明线粒体在成骨细胞分化过程中发挥着不可或缺的作用，并证明了SIRT3/SOD2控制着成骨性分化以及调节着线粒体氧化还原和体外以及体内的骨形成。因此SIRT3在鼠趾再生过程中对成骨细胞的作用也是至关重要的。

2.4 α-MSH激活黑素皮质素-4受体信号刺激神经依赖性小鼠趾头再生

在利用Mc4r-gfp小鼠分析了Mc4r在胚胎和产后小鼠肢体中的表达动力学研究中发现，Mc4r-GFP主要表达在肢体神经和正在经历继发性肌发生的肢体肌肉中。Mc4r-GFP在成人小鼠趾头中的表达仅限于指甲基质。在α-MSH对鼠趾再生的影响的研究中，研究者发现在Mc4r+/-小鼠中使用α-MSH可以避免远端趾尖延迟再生。α-MSH可以避免退化的后肢的远端指头再生。总之，小鼠肢体和手指中的Mc4r表达与神经组织密切相关，与α-MSH/MC4R密切相关信号传导在小鼠趾尖再生中起神经营养作用[31]。

2.5 Msx基因参与鼠趾再生

鼠趾趾尖的发育是上皮细胞与间充质细胞相互作用的结果，受到许多发育调节因子的调控。同源异型盒基因Msx是鼠趾发育的重要调控基因，其编码蛋白在鼠趾发育的启动、定位和构型中起着重要作用。Msx基因在肢体顶端间充质中的表达依赖于来自AER的信号传导，以及与临近间充质细胞的相互作用[16]。在小鼠胚胎发育过程中，Msx1和Msx2的转录都受到小鼠远端鼠趾结构细胞的影响，同时Msx1和Msx2均在出生时鼠趾甲床和毛囊细胞中表达。另外发现鼠趾趾尖的再生能力仅限于截肢平面在Msx1区域内的水平[32]。事实上，先前的研究证实，BMP下游的转录因子Msx2和Foxn1在甲床细胞终末分中是必不可少的。Msx2突变体的特征具有在生角质区中分化差的特征，硬角蛋白的产生减少。在 Foxn1突变体中，硬角蛋白的表达甚至更低，表现为指甲断裂[33]。

综上所述，Msx在鼠趾的再生过程中起到了很好的促进作用[34]。

2.6 Sox2基因对于鼠趾再生的作用

Sox2基因属于Sox基因家族，在早期胚胎发育过程中广泛表达于各种细胞，在维持胚胎早期细胞的多能性、细胞向神经细胞分化、性发育、软骨和血细胞形成等方面发挥着重要作用[35]。Sox基因家族编码一组进化上高度保守、结构上与SRY相关的转录因子；同时相关研究已经表明，Sox2可能是通过它在施万前体细胞(schwann cell precursor,SCP)中的作用来发挥其对鼠趾的再生作用[36]。

3 总结与展望

BMP是调控鼠趾再生的关键信号分子，TGF-β超家族组成员BMP-3B和GDP-10的生物学功能还是未知，但可能参与成骨细胞的分化、增强BMP2的活性，所以有待进一步进行研究和发现其在鼠趾再生过程中的具体作用。此外，目前的研究表明，SIRT3可能发挥着破骨细胞分化的分子刹车作用；但还需要对SIRT3作用的分子机制进行更深入的研究，以了解SIRT3是否真正充当PGC-1β和AMPK之间的桥梁。这些努力不仅会增进我们对骨稳态的理解，而且可能为鼠趾再生和骨科疾病治疗的干预提供新的方法[27]。另外，SIRT3/SOD2激活的机制应进一步探索，并确定成骨细胞和破骨细胞之间的分子相关性，以便进一步证实在有机体的疾病和衰老过程中SIRT3/SOD2发挥着线粒体中心调节器的作用，最终在未来可以为与年龄相关的骨科疾病提供新的治疗方法。