白念珠菌细胞壁结构及其与宿主相互作用的研究进展

梅一堃，谭镜璁，王安君，王 慧，刘宁宁

上海交通大学公共卫生学院，上海 200025

作为人体真菌微生物组的重要组成部分，白念珠菌是常见的条件性致病真菌之一，定植于大多数人体的胃肠道、生殖道、口腔和皮肤［1］。在具有健康免疫系统的个体中，白念珠菌通常是无害的，与局部微生物群的其他成员保持平衡。然而，宿主微生物群的改变（例如广谱抗生素的应用）、宿主免疫反应的改变（例如在压力、其他微生物感染或免疫抑制剂治疗期间）或局部环境的变化（例如pH 值或营养成分的变化）可使白念珠菌过度生长并引起感染。这些感染包括浅表黏膜和皮肤感染，如鹅口疮、阴道念珠菌感染、尿布疹以及血液感染（死亡率高达40%［2］）。白念珠菌感染引起的阴道炎症状被认为是源于宿主免疫反应，而不是病原体介导的损伤［3］。宿主炎症过程可由真菌细胞壁分子和蛋白质触发，它们与先天免疫细胞和上皮细胞的受体相互作用［4-5］。尽管真菌细胞壁成分具有公认的炎症刺激能力，但研究者对在阴道感染等感染过程中可用于免疫识别的真菌细胞壁成分仍知之甚少。

真菌细胞壁是高度动态的复杂结构，发挥维持细胞形状和保护细胞的作用。细胞壁的坚固性是维持真菌形态的关键。白念珠菌细胞壁作为抵御外界侵害的第一道防线，是真菌和宿主之间的第一接触点，因此细胞壁对于真菌-宿主相互作用和免疫识别至关重要，是抗真菌治疗的潜在靶点。细胞壁由含有几丁质和β-葡聚糖（β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖）的内骨架层和含有高糖化甘露糖蛋白的外层组成［6］。念珠菌细胞壁是真菌表面病原体相关分子模式 （pathogen-associated molecular pattern，PAMP） 和天然免疫细胞上病原体识别受体（pattern recognition receptors，PRR）之间分子相互作用的复杂基质。PAMP-PRR 相互作用对识别真菌病原体和启动适当的免疫反应均至关重要［7］。本文综述了白念珠菌细胞壁结构及其在宿主应答过程中的作用，以期为抗真菌药物研发提供新的研究线索和理论依据。

1 β-葡聚糖结构特点与功能

1.1 结构特点

β-葡聚糖是白念珠菌细胞壁主要成分，占细胞壁质量的50%～60%；葡聚糖形成一个刚性骨架，维持细胞的形状和物理强度［8］。

1.2 对白念珠菌压力响应的影响

β-葡聚糖重塑是白念珠菌菌丝生成的基础。由pH 应答基因1 （pH-responsive gene 1，Phr1） 编码的蛋白PHR1p 在中性和碱性pH 条件下负责β-葡聚糖重塑。PHR1p 在菌丝细胞壁压力响应的适应性反应中具有重要作用。Phr1缺失可改变全基因组的表达谱，从而影响新陈代谢、物质运输、细胞周期、DNA 复制、转录和应激反应等多种功能和体内平衡。此外，黄素载体2（flavin carrier 2，Flc2）编码一种假定的钙转运蛋白，其在酿酒酵母中参与低张性休克时细胞内钙的释放［9］；Flc2基因的缺失导致介导细胞壁完整性的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 通路过度激活，因此FLC2 对于维持细胞壁发挥了重要作用。在严重菌丝细胞壁压力的情况下，几丁质合酶8（chitin synthase 8，CHS8）对白念珠菌在琼脂平板上的生长也具有保护细胞壁完整性（cell wall integrity，CWI）的重要作用。

1.3 对白念珠菌宿主识别的影响

口腔角质形成细胞是宿主抵御口腔念珠菌感染的第一道防线。真菌细胞壁成分与口腔角质形成细胞的相互作用可调节宿主对念珠菌感染的应激反应。血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，Ho-1）是一种应激诱导基因，其表达水平在热灭活和活白念珠菌刺激的口腔角质形成细胞中增加。白念珠菌感染后口腔上皮表层HO-1 的表达明显高于健康口腔上皮。含β-葡聚糖的颗粒（β-glucancontaining particles，β-GPs）通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）/p38 MAPK/核转录因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，NRF2）通路增加HO-1的表达［10］。此外，在热灭活和侵袭口腔上皮的白念珠菌细胞壁表面均发现β-葡聚糖。HO-1 可能在宿主防御白念珠菌感染引起的口腔上皮应激中起重要作用。

低氧是感染生态位的一个主要特征，感染部位具有强烈免疫活性的区域。低氧对微生物和免疫细胞及其相互作用均有影响。牙囊为低氧区，牙周病的严重程度随着白念珠菌的存在而增加［11］。 多形核白细胞（polymorphonuclear leucocyte，PMN）高度浸润感染部位易形成小鼠真皮下脓肿的低氧环境。持续缺氧环境不影响PMN 的活性和代谢。然而，在缺氧条件下，白念珠菌感染干扰了特定的PMN 反应。PMN 不能有效地吞噬细胞、产生ROS 或释放细胞外DNA 陷阱（neutrophil extracellular traps，NET）。暴露于低氧水平时，β-葡聚糖对白念珠菌细胞壁的掩蔽导致宿主未能对白念珠菌侵入产生足够的反应，阻碍了树突状细胞（dendritic cell，DC） 相关性C 型植物血凝素（DC-associated type C phytohemagglutinin，dectin-1） 对PMN 表面的PAMP 传感，导致真菌存活率提高。低氧条件下PMN 产生的乳酸增强了细胞壁掩蔽效应［12］。因此，白念珠菌适应机体缺氧环境也依赖于β-葡聚糖在细胞表面暴露减少。生长和氧化适应蛋白1（growth and oxidant adaptation 1，Goa1）和摄入控制蛋白2（uptake control 2，Upc2）缺失导致的线粒体功能突变和超氧化物歧化酶1 （superoxide dismutase 1，Sod1）缺失，使得内膜过氧化氢减少从而阻断β-葡聚糖水平的降低。此外，β-葡聚糖的掩蔽作用通过提高乙醇氧化酶（alcohol oxidase I gene，Aox1）突变水平增强线粒体ROS 水平的积累。白念珠菌还可通过线粒体环单磷酸腺苷-蛋白激酶A （cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A，cAMP-PKA）信号途径诱导β-葡聚糖掩蔽，通过调节局部免疫反应、促进真菌定植而对缺氧生态位做出反应。

1.4 对白念珠菌免疫识别的影响

Dectin-1 是一种髓样表达的酪氨酸激酶偶联受体，可以识别各种真菌表面的β-1,3-葡聚糖碳水化合物［13］。研究［14］表明，dectin-1 的Y238X 位点突变患者对白念珠菌黏膜感染高度敏感。然而，活的白念珠菌（包括酵母和菌丝形式），除了亲本酵母细胞和成熟芽之间的区域，其他区域可在体外与dectin-1 高度特异性结合［15］。在感染早期，白念珠菌的β-1,3-葡聚糖被完全掩盖［16］。通过逃避dectin-1 介导的免疫识别，β-1,3-葡聚糖的屏蔽有利于真菌存活［17］。研究［18］表明，通过药物处理和关键基因缺失等方法可使白念珠菌β-1,3-葡聚糖和甘露聚糖暴露，从而引起宿主对白念珠菌更强的免疫应答。此外，决定白念珠菌胃肠道适应度的关键因素是细胞表面β-葡聚糖的暴露水平，这也与宿主细胞上dectin-1 受体的信号传递强度有关。β-葡聚糖掩蔽和暴露的动态性质被证明与形态发生有关，在全身感染期间发挥重要作用［19］。β-葡聚糖暴露对白念珠菌在其主要自然生态位（即哺乳动物胃肠道）定植的能力产生了较大的负面影响，因此β-葡聚糖是减少系统性念珠菌病患者真菌定植的潜在靶点。

1.5 对抗真菌药物活性的影响

以细胞壁β-1,3-D-葡聚糖为靶点的新一代棘白菌素被证明是治疗条件致病真菌如白念珠菌的有效药物［20］。另外，Liu 等［21］通过对磷酸转运受体PHO84 蛋白的研究发现，PHO84 可以通过磷酸代谢影响多聚糖合成最终导致CWI受损；PHO84缺失可以降低β-葡聚糖合成酶和几丁质合酶（chitin synthase，CHS）的活性，最终降低白念珠菌细胞壁的合成量。磷酸盐的摄入在真菌和人类细胞之间并不保守，人类也不会合成β-葡聚糖或几丁质。因此，同时抑制这些过程可以产生有效的抗真菌作用，且对人体毒性较低［21］，是一种切实可行、有效的抗真菌策略。

2 甘露聚糖结构特点与功能

2.1 结构特点

细胞壁的甘露聚糖部分占其干重的40%，其对于黏附、CWI、免疫识别十分重要［22］。N-甘露聚糖的核心结构是由3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺残基组成的聚焦磷酸二氢氯醇寡糖。外部支链甘露聚糖通过α-1,6-主链连接到N-甘露聚糖核。酵母细胞壁中有2 种主要的甘露糖结合蛋白，大多数是糖基磷脂酰肌醇修饰蛋白，它们通过α-1,6-葡聚糖共价连接到β-葡聚糖网络。其他甘露糖结合蛋白具有内部重复序列，通过碱敏感键与β-1,3-葡聚糖相连［23］。细胞壁蛋白通常通过O-键和N-键［24］进行甘露糖基化，包括结构分子、细胞壁重塑酶、黏附素和促进致病性以及CWI的入侵相关蛋白［25］。

2.2 对白念珠菌免疫逃逸的影响

DC 通过C 型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLR）、巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor，MMR）和DC 特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子（DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN）与白念珠菌细胞壁的甘露聚糖结合，是机体免疫识别的重要过程。有趣的是，虽然MMR能识别单端甘露糖残基，DC-SIGN 可与更复杂的甘露糖残基在特定构象中相互作用，但同样的甘露糖基化突变可阻碍DCSIGN 与念珠菌结合，从而使DC 解除随后的吞噬作用。这表明尽管受体不同，但DC 对念珠菌的免疫感应均需要N-连接的甘露寡糖。

甘露糖基转移酶10 （mannosyltransferase 10，MNN10）是顺式高尔基甘露聚糖聚合酶的一个重要亚基，被鉴定为α-1,6-甘露糖基转移酶，负责非致病真菌如酿酒酵母和乳酸鲁维酵母中甘露聚糖骨架的延伸［26］。细胞壁α-1,6-甘露糖骨架通过阻止宿主dectin-1介导的β-1,3-葡聚糖识别来维持白念珠菌的致病性。抑制白念珠菌α-1,6-甘露糖骨架的伸展，可以增强T 淋巴细胞介导的体内免疫应答［27］。甘露聚糖结构改变导致葡聚糖暴露的表面密度和暴露面积增加。然而，白念珠菌细胞壁上的大多数葡聚糖暴露位点由多个葡聚糖结合位点组成［28］。这些更复杂的多聚结构很可能在确定dectin-1 的多聚体和启动念珠菌物种的先天免疫反应方面发挥关键作用［29］。

细胞壁O-甘露聚糖的丢失与吞噬体成熟标志物的获得、p21 Ras小GTP酶（GTPase）超家族成员Rab-GTPase的显著变化、巨噬细胞吞噬体内菌丝的生长受损及巨噬细胞肌动蛋白动力学的变化密切相关，最终导致真菌细胞逃离巨噬细胞吞噬体的能力降低。细胞壁O-甘露聚糖的丢失导致细胞壁内β-葡聚糖的暴露，促进dectin-1对细胞壁的识别，而dectin-1与吞噬体的成熟有关［30］。

2.3 对其他微生物定植的影响

戈登链球菌 （Streptococcus gordonii，S. gordonii）是一种普遍存在的口腔细菌，已被证明可与白念珠菌形成生物膜群落。白念珠菌生物膜群落的形成涉及白念珠菌菌丝表面S. gordoniiSspB 蛋白与凝集素样序列3（agglutinin-like sequence，ALS3）蛋白的相互作用。研究［31］表明，早期的O-甘露糖基化对激活生物膜形成所需的菌丝黏附素功能、被S.gordonii等细菌识别和微生物群落发育至关重要。

3 几丁质结构特点与功能

3.1 结构特点

就生物量而言，几丁质是细胞壁中一类相对较小的组成部分（占1%～3%），但在所有已被研究的真菌物种中，几丁质对细胞活力的维持至关重要［32］。与β-葡聚糖网络共价交联的几丁质聚合物被认为有助于维持酵母细胞壁的刚性和物理强度［33］。几丁质含量降低失会导致细胞壁弹性增加，而其含量升高则会导致相反的结果［34］。细胞壁大分子之间的交联是由位于细胞壁的碳水化合物活性细胞壁重塑酶催化的［35］。这些细胞壁重塑酶包括β细胞壁葡聚糖糖基转移酶家族（PHR1、PHR2、PGA4 和PGA5）［36］和几丁质-葡聚糖糖基转移酶家族（CRH11、CRH12 和UTR2）［37］，此外，白念珠菌含有一个由CHS1（Ⅱ类）、CHS2（Ⅰ类）、CHS3（Ⅳ类）和CHS8（Ⅰ类）组成的CHS基因家族。将β-半乳糖苷酶报告基因LacZ融合在每个CHS启动子上，以检测几丁质合成的转录调控。每个CHS启动子都有一个独特的调控模式，对细胞壁损伤剂、特定CHS基因突变和外源Ca2+存在反应。CHS基因表达和几丁质合成的调控由蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、高渗甘油反应1 （high osmolarity glycerol response 1，HOG1）激酶和Ca2+/钙调神经磷酸酶信号通路协同完成。这些途径的激活也导致体外CHS 活性增加和细胞壁几丁质含量升高［38］。

3.2 对白念珠菌适应极端环境的影响

白念珠菌对极端pH 值环境的适应也依赖于细胞壁重塑。酸性环境中，几丁质酶2（chitinase 2，CHT2）受B细胞抗原受体（B-cell receptor 1，BCR1）-锌指转录因子RIM101 依赖性信号调控，表达降低；转录因子EFG1 为几丁质暴露的调节因子［39］，可导致几丁质长度改变，使细胞壁结构重塑。这就解释了在胃的酸性环境中，白念珠菌为何仍能生存。在阴道乳酸菌存在的酸性环境中，虽然白念珠菌生物膜形成被抑制，但白念珠菌细胞仍能定植生存［40］。

白念珠菌可以在42 ℃的环境下生存。热应激也可以激活白念珠菌的Mkc1（MAP kinase fromC.albicans）信号通路，导致几丁质含量升高，使得细胞壁更加坚固，这是由于在42 ℃时几丁质水平增加和对细胞壁损伤敏感性提高。热处理的压力响应似乎与各种表面应激压力相似，导致Mkc1 信号被激活，某些修复相关的细胞壁蛋白增加，细胞分离酶减少，导致细胞壁与几丁质强化以及相关的细胞分离减少［41］。因此，几丁质对于白念珠菌在高温环境下生存也有重要的意义。

3.3 对白念珠菌免疫逃逸的影响

Dectin-1 是一种模式识别受体，可以通过其胞质信号结构域介导多种细胞功能，包括吞噬、呼吸爆发和可溶性因子（如细胞因子、趋化因子和二十碳烯酸）的产生［42］。白念珠菌侵入人体后，人体巨噬细胞通过释放一氧化氮来达到杀菌效果，而几丁质成分介导人巨噬细胞精氨酸酶-1 影响巨噬细胞产生一氧化氮，以保护自身存活。因此，几丁质酶抑制剂也是治疗白念珠菌感染的有效药物［43］。这对我们研究白念珠菌与免疫系统之间的相互作用提供了新的思路，对了解人类对白念珠菌的易感性和白念珠菌感染的治疗具有重要意义。

4 白念珠菌中维持CWI的主要信号通路

CWI 相关主要信号通路负责维持刚性且动态的细胞壁，这对于菌丝生长、适应环境挑战以及宿主入侵和定植都很重要［44］。CWI 的功能依赖于外部传感器的激活和MAPK 级联的下游激活，后者反过来靶向作用于磷酸化转录因子，最终诱导参与细胞壁强化的不同蛋白质的表达［45］。在白念珠菌中，已经确定了3 种主要的MAPK 途径，并确定了它们在真菌毒性和发病机制中的重要性［46］。PKC 途径在细胞壁生物发生、应激反应和形态发生等方面发挥着重要作用，影响生物膜的形成和毒力［47］。高渗甘油反应途径主要参与应激反应和适应，但也参与形态发生、毒力形成和细胞壁的生物发生［48-49］。CEK1 蛋白能对细胞壁抑制剂做出感应而发生磷酸化反应，其激活也受群体感应和生长的调节。由于其在细胞壁生物发生中的重要性，CEK1介导的信号转导途径中关键因子的缺失将导致菌株细胞表面β-1,3-葡聚糖暴露程度升高，从而使与免疫受体dectin-1 结合的真菌细胞数量随之增加，吞噬作用和巨噬细胞活化作用增强［50］。

5 展望

白念珠菌侵染人体主要引发口腔念珠菌病、胃肠道念珠菌感染以及阴道念珠菌病等。针对不同部位的感染特点，可以研发特异性的抗真菌感染策略防止白念珠菌定植，其中白念珠菌细胞壁结构组成成分是决定白念珠菌定植能力的重要因素。

白念珠菌细胞壁的甘露聚糖组分对于其黏附和免疫识别至关重要。细胞壁α-1,6-甘露糖骨架通过阻止宿主dectin-1 介导的β-1,3-葡聚糖的识别来维持白念珠菌的致病性。早期的O-甘露糖基化对激活生物膜形成所需的菌丝黏附素功能至关重要。几丁质不仅可影响细胞壁重塑，对于白念珠菌适应极端pH 环境具有重要意义，还可使其避免受到人体免疫识别和巨噬细胞杀伤。此外，其对白念珠菌的热应激保护也有重要作用。

CWI 对于菌丝生长、适应环境应激以及入侵和定植宿主都很重要。细胞壁生物合成的许多特征是真菌特有的，因此细胞壁被认为是抗真菌药物开发的良好靶点。未来的研究可以结合细胞壁不同组分的特点建立体外模型，从而明确它们之间的作用关系，并筛选更多特异性抗真菌治疗药物，为开发细胞壁作为抗真菌药物靶点提供良好的试验工具。