ctDNA 在结直肠癌诊疗中的应用

刘 莉 蒋 萍 戈 伟

泰康同济（武汉）医院肿瘤科，湖北武汉 430050

结直肠癌是常见的消化系统肿瘤之一，由于结直肠癌起病隐匿，早期症状不明显且不典型，缺乏特异性，有时与其他消化系统疾病共存，因此结直肠癌发现时多为中晚期，部分患者出现转移灶。而目前临床上，结直肠癌的早期筛查往往依赖于粪便隐血试验（fecal occult blood test，FOBT），缺乏灵敏度和特异性，容易导致漏检和过度检测，临床中急需开发高特异性的筛查方法[1]。同时，结直肠癌治疗手段仍有限，诊疗效果一定程度上取决于高效精准的个体化治疗方案的制订。因此，对肿瘤的分子遗传信息的动态掌握成为了结直肠癌诊治的重点和热点。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血浆中的单链或者双链DNA 片段，携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学信息。ctDNA 液态活检技术具有无创、能够实时反映肿瘤基因组信息、特异性高、灵敏度高、准确度高等优势，能够对肿瘤患者的病程发展及治疗进行实时监控。由此，ctDNA 逐渐成为了癌症预防、诊断、治疗研究的一大热点[2]。目前，基于ctDNA的结直肠癌检测平台技术主要有实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、磁珠乳液扩增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）、下一代测序（next-generation sequencing，NGS）等[3]。下面将从ctDNA检测在结直肠癌早期筛查中的应用，在分子诊断与用药指导中的应用以及预后评估等多方面展开综述。

1 ctDNA 在结直肠癌早期筛查中的应用

根据最新肿瘤流行病学研究显示，我国结直肠癌Ⅰ期和Ⅱ期的5 年生存率分别为90%和70%，而Ⅲ期和Ⅳ期结直肠癌患者5 年生存率仅有50%和10%[4]。因此，针对高龄、吸烟、长期高脂饮食、具有结直肠癌家族史，患有炎症性肠病等高危人群开展结直肠癌的早期筛查，开展有效的肿瘤二级预防具有重要意义，可降低结直肠癌的死亡率[5-6]。目前，我国结直肠癌的早期筛查方法主要有直肠指检、FOBT 和肿瘤相关蛋白标志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，CA19-9）检测等，然而这些检测方法灵敏度和特异性均有限[7]。而作为诊断结直肠癌金标准的结肠镜作为一项高成本、患者依从性较差、且具有潜在风险和并发症的检查，难以成为民众早期筛查的工具[8]。得益于ctDNA的液态活检技术具有高灵敏度和非侵入性等特点，使其有望成为结直肠癌早期筛查的理想选择[9]。有研究表明，通过检测结直肠癌相关的关键基因的ctDNA的突变情况、甲基化水平、羟甲基化水平等，可有效做到结直肠癌的早期筛查[10]。

1.1 ctDNA 基因甲基化水平检测在结直肠癌早期筛查中的应用

研究指出，与结直肠癌发生相关的基因甲基化水平变化往往早于相关基因突变的发生，即在癌症早期。因此，结直肠癌发生相关的基因的甲基化水平的检测，可应用于结直肠癌的早期筛查和诊断[11]。近年来研究报道中关于结直肠癌早期筛查常用的甲基化基因 标 志 物 有：SEPT9、SDC2、SFRP2、ALX4、TMEFF2、NGFR、p14、p16、APC、BCAT1、IKZF1、DAPK、HLTF、hMLH1、MGMT、RARβ2、RASSF2A、WIF-1、VIM、BMP3、NPTX2、RARB 等[12-13]，其中SEPT9 是一种抑癌基因，位于17 号染色体q25.3，编码GTP 结合蛋白，其主要功能是调控细胞凋亡及细胞分裂，多数结直肠癌患者存在该基因启动子区域的甲基化水平升高，进而引发异常的细胞分裂诱发癌变。目前，SEPT9 甲基化水平检测结直肠癌的灵敏度可达69%，特异性达92%，相关检测试剂盒已于2016 年被美国食品和药品管理局批准应用于临床，国内也已有相关产品开发[14-15]。2020 年最新研究基于机器学习的生物信息学算法筛选出的cg10673833 位点，其甲基化水平可以作为结直肠癌和癌前病变，晚期腺瘤的检测标志物。对1493例结直肠癌高危人群开展检测，检测灵敏度达89.7%，特异性达86.8%[16]。

然而，单一位点甲基化检测的灵敏度和特异性仍有限，研究表明，检测多个结直肠癌关键基因位点的甲基化水平可增强结直肠癌的早期筛查的灵敏度和特异性[17]。例如，采用qPCR的方法联合检测SEPT9和SDC2 甲基化水平，晚期腺瘤和Ⅰ期肠癌的检测灵敏度分别提升至47.8%和80.0%，全部分期的结直肠癌检测灵敏度达88.9%，特异性达92.8%[18]；联合检测ctDNA 中SDC2 和SFRP2 甲基化水平，结直肠癌检测灵敏度达76.2%，特异性达87.9%[19]；联合检测ctDNA中C9orf50、KCNQ5、CLIP4 3 个基因的甲基化水平，检测结直肠癌的灵敏度达78%，特异性达99%[20]。

1.2 ctDNA 羟甲基化水平、突变、拷贝数变异等其他检测在结直肠癌早期筛查中的应用

DNA的羟甲基化也是表观遗传学的重要修饰，其与基因调控和肿瘤发病机制相关，是近年来新兴的检测技术，推动了结直肠癌的早期筛查，灵敏度可达83%。特异性可达94%[21-23]。

近年来也有检测相关基因突变来筛查早期癌症的相关报道，但由于单独检测突变往往不能做到很好的预测，早期癌症和癌前病变往往相关突变频率较低，且ctDNA 含量也较低，检出率低，灵敏度较低，容易导致漏检。联合检测相关基因突变和蛋白标志物的cancerseek 技术可用于多种癌症的早期筛查，其中，结直肠癌的cancerseek 灵敏度达64.9%，特异性达99.1%[24]。

基因组不稳定性，特别是拷贝数变异（copy number variation，CNV）是癌症的一个特征，已被证明具有潜在的临床应用价值。进行拷贝数变异检测也可以对结直肠癌进行预测，灵敏度为91.7%，特异性为88.9%[25]。

综上，随着更大样本数量的大规模研究开展，高效的结直肠癌早筛检测基因标志物的发现，PCR、测序文库构建和NGS 等技术的不断发展和革新，使得更加便捷、高灵敏度和特异性的ctDNA 检测手段和体外诊断产品（in vitro diagnostic products，IVD）将走向临床，得益于目前新兴的生物信息学算法的引入，以上发展将在一定程度上降低结直肠癌的死亡率，以期达到结直肠癌早诊早治的目的。

2 ctDNA 在结直肠癌分子诊断和用药指导中的应用

目前，针对结直肠癌的确诊主要依赖于结直肠镜和病理学检测，针对结直肠癌的治疗方法主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等。对于结直肠癌患者，特别是针对中晚期原发性结直肠癌和转移性结直肠癌患者，取得组织样本较为困难，因此，采用基于ctDNA的液态活检策略检测RAS（KRAS、NRAS、HRAS），BRAF，HER2（ERBB2），EGFR，TP53，PIK3CA，APC，MET，GNAS 等基因突变，评估微卫星不稳定性，对结直肠癌的分子诊断和个体化用药指导具有重要意义[26-27]。

2.1 ctDNA RAS 基因突变在结直肠癌分子诊断和用药指导中的应用

在多种突变中，RAS 相关基因的突变检测对靶向治疗的选择有着决定性的作用，其中KRAS 是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）下游信号通路的重要效应因子，主要激活RAF-MAPK通路，参与生长调控，在抗细胞凋亡，介导肿瘤侵袭和转移中起到关键作用[28]。存在KRAS 和NRAS 基因突变的患者往往对EGFR 抑制剂（如西妥昔单抗）不敏感，其中约有40%的转移性结直肠癌患者存在KRAS突变，以发生在右侧结肠癌者为主，有4%的转移性结直肠癌患者存在NRAS 突变，以发生在左侧结肠癌的女性患者为主。KRAS 突变中，2 号外显子突变发生率最高，主要发生在12 号和13 号密码子，例如，2 号外显子G12C、G13D 突变预示着较差的预后，G12D、G12V 则与预后相关性不大。KRAS的3 号和4 号外显子，以及NRAS的2、3、4 号外显子突变患者对EGFR抑制剂响应也较差[29]。

因此，在结直肠癌患者中开展RAS 相关基因突变的检测对诊疗中EGFR 抑制剂的使用起到指导性作用。

2.2 ctDNA 其他基因突变在结直肠癌分子诊断和用药指导中的应用

BRAF 基因是RAS 基因下游一种丝氨酸苏氨酸激酶基因，BRAF的激活在多种肿瘤的发生发展中起到关键作用，该基因突变导致MAPK 信号通路活化，诱发癌症发生。该基因中V600E 突变常发现于女性和年老者，存在该基因突变者可能对西妥昔单抗耐药，对治疗及预后产生不利影响[30]。KLF4 基因的A472D突变也会导致患者对EGFR 抑制剂耐药，其与下游EGFR 蛋白磷酸化增强有关[31]。NTRK1 基因G595R 和G667C 突变导致了结直肠癌患者对广谱抗癌药TRK抑制剂恩曲替尼的耐药[32]。

因此，对于不存在RAS 和BRAF 等相关基因突变的结直肠癌患者，可考虑联合使用化疗药物和EGFR抑制剂及抗血管内皮生长因子受体（vascular en dothelial growth factor，VGFR）抑制剂，以期获得最大获益[33]。

由于结直肠癌一般对常规化疗欠敏感，早期患者根治术后一般不需要化疗，在中晚期手术前减低肿瘤大小，降低分期，以及促进术后康复，临床中氟尿嘧啶、亚叶酸钙、奥沙利铂三联用药是常规的化疗方案；而对于高度的微卫星不稳定性的患者，在Ⅱ期术后，单药氟尿嘧啶类药物不获益，则可采用免疫治疗中的免疫检查点抑制剂纳武单抗[34-35]。因此，评估微卫星稳定性对于是否采取常规化疗和免疫治疗具有指导意义。

随着更多靶向药物、免疫治疗药物的开发和上市，利用动态ctDNA 针对结直肠癌相关基因位点的突变检测和微卫星不稳定性的评估，将为中晚期结直肠癌的用药提供重要指导。同时更多关键有意义的基因突变位点的发现，也将为抗肿瘤药物的开发提供更多药物关键靶点，助力抗肿瘤药物的发展。

3 ctDNA 在结直肠癌预后判断中的应用

结直肠癌明确诊断和接受相关治疗后，其疗效的预后评估和治疗策略的及时调整在康复、延长生存时间、降低死亡率等方面是至关重要的。ctDNA 在结直肠癌预后中的效果明显优于其他影像学检测和肿瘤蛋白标志物检测。通过检测结直肠癌患者术后血浆ctDNA 中APC、TP53 和KRAS 等基因突变情况来判断肿瘤复发，其灵敏度和特异性均可达100%[36]。联合检测BCAT1、IKZF1 甲基化在检测结直肠癌复发的灵敏度上明显优于CEA 检测[37]。患者在接受结直肠癌切除术或接受其他治疗方案（如辅助化疗，靶向治疗，免疫治疗）后，开展基于ctDNA的液态活检，可以提早、特异性地检测到微小转移灶，有效地预测复发转移风险，又能避免部分术后治愈的患者接受过度的辅助治疗。

此外，对于接受化疗和靶向治疗的患者，如在药物使用过程中出现不利的基因突变时可以及时更换疗法，减少毒副作用，避免延误治疗时机，做到精准调整治疗策略[38-40]。在接受靶向药物治疗后的耐药分析中，KRAS、BRAF、EGFR 等基因突变频率的改变及新发突变都意味着可能发生耐药和预后较差[41-42]。研究发现在肿瘤组织KRAS 野生型的结直肠癌患者中使用靶向EGFR的治疗药物，部分耐药患者的ctDNA中检出KRAS 突变。出现以上结果的可能解释有两种，一是药物的选择性筛选作用，在原发肿瘤组织中本身存在极低频的突变，因检测技术灵敏度有限未检出，而靶向药物治疗过程中选择性地杀死了未发生突变的肿瘤细胞，残存了含有KRAS 突变的肿瘤细胞则生长，进而在血液中被检出。另一种解释为获得性突变，即在靶向药物治疗过程中，肿瘤细胞为了适应或抵抗药物所致的生存环境的恶劣变化，获得新的突变。这些解释在其他研究工作中得到了证实[43-44]。

因此，针对结直肠癌患者治疗后开展ctDNA 检测，能够使临床医生及时获得可能对患者具有前瞻性或者随访有用的信息，对不利的结果可以做到及时干预，最大可能延长患者生存期。

4 总结与展望

基于ctDNA 检测的液态活检技术在结直肠癌早期筛查、分子分型，检测术后微小残留、用药指导、预测治疗效果、监测耐药、术后肿瘤复发监测等多方面，具有无创、实时动态和克服肿瘤异质性等多种优势。检测技术上，随着qPCR、ddPCR、NGS 等大量检测技术的发展，提高了其检测的准确性和灵敏度；随着检测文库的构建技术发展，分子标签UMI的引入克服了低分子量和标签跳跃等技术问题；随着基础医学，分子生物学等多基础学科的发展，更多关键标志物的发现，基于ctDNA的结直肠癌液态活检将不断推动临床诊疗的不同层面发展和抗肿瘤药物的开发，更好地为肿瘤高危人群提供检测服务，为肿瘤患者提供更精准的个性化治疗策略。