几丁糖对大鼠颞下颌关节滑膜炎的疗效研究*

张清彬 曹威 吴丽红 朱明静 罗倩婷 黎星阳 刘洪臣

颞下颌关节滑膜炎是一种由多种因素共同作用导致关节软骨退行性的病变，关节软骨的严重磨损和退化变性是其主要病变表现［1，2］。颞下颌关节滑膜炎是颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular Disorders，TMD）在临床上较常见的分类之一，其治疗的重点在于如何有效止痛，这同时也是一个重要的研究和发展方向。滑膜炎的临床治疗中仍然没有找到一种理想的治疗方案，即安全有效、操作简便且价格低廉、可用于持续推广临床使用的药物和方法，每种疗法都有其一定的局限性。目前临床中常通过在患者的关节腔内注射透明质酸钠以有效减轻滑膜炎患者的关节疼痛症状［3，4］。几丁糖是一种纯天然多糖类液态生物材料，常广泛应用于防治各种关节组织术后的粘连及膝关节炎，具有止血、促进创伤愈合、抑制成纤维细胞生长等临床治疗功能［5，6］。然而相比于膝关节炎，颞下颌关节滑膜炎在临床上有着不同的临床发生与进展及其发病的机制，几丁糖能否可以同有效治疗膝关节炎那样有效治疗及改善颞下颌关节滑膜炎的病程进展仍有待进一步研究［7］。因此，本实验旨在通过在罹患颞下颌关节滑膜炎的大鼠的颞下颌关节上腔内注射几丁糖以观察其对颞下颌关节滑膜炎的临床治疗作用效果。

1.材料与方法

1.1 动物模型建立及实验分组 建立颞下颌关节滑膜炎的动物模型及注射目标药物动物实验在广州医科大学附属第一医院动物实验室进行［实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0093］。30只9周龄，体重250～300g的清洁级SD大鼠（雄性）购自中国南方医科大学动物实验中心［生产许可证号代码号：SCXK（粤）2016-0041］，饲养环境条件为温度25℃、相对湿度（55%）、人工照明（08∶00～20∶00），喂饲原料为消毒的纯净水和人工消毒的标准普通饲料。将30只大鼠注射卡拉胶用以建立颞下颌关节滑膜炎模型，1周后，待动物模型建立成功后将大鼠按照完全随机分配的方法分为3组，每组各10只，分组治疗的具体情况如下：空白组，只行颞下颌关节穿刺，不注射药物；对照组，注射100μL透明质酸；实验组：注射100μL几丁糖。

麻醉大鼠为在其腹腔注射浓度为30mg/kg的戊巴比妥钠（浓度为10mg/mL）。在外耳眼眶连线上1mm外耳前2mm处用胰岛素注射器向关节上腔中注射药剂。研究中使用的卡拉胶和透明质酸浓度均为3%［8］。用32G针头向两侧颞下颌关节腔中注入100μL卡拉胶（Sigma，美国）诱导关节炎症。一周后，按照上述方法注射1次几丁糖及透明质酸。药物注射后1周后抽取关节液，注射4周后分别称重及抽取关节液后处死动物。

1.2 动物称重 动物体重及进食情况分别于实验前后记录每只大鼠体重。饲养大鼠时，实验开始时每笼饲料量为1000g，之后每次每笼均投放1000g，实验周期结束时称量每笼剩余饲料量。

1.3 关节液中总蛋白及各种细胞因子的检测 利用ABC-ELISA试剂盒进行检测IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的浓度，试剂盒为上海森雄科技实业有限公司生产和进口分装的产品，其细胞因子灵敏度均为16pg/mL。对关节液中各种总蛋白的细胞因子检测采用双金鸡宁酸法（bicinchoninic acid，BCA），试剂盒购自一家美国HyClone-PIERCE公司，其灵敏度为20μg/mL。此外，本实验以IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的蛋白比浓度取代体积比浓度，以减小因不同稀释度造成的实验误差。

1.4 动物处理 安乐死与取材大鼠安乐死采用过量药物麻醉后断头的方法进行，过量麻醉方法为：腹腔注射，100mg/kg，20mg/mL戊巴比妥钠。安乐死动物后，取每组4只大鼠的颞下颌关节软骨并用4%多聚甲醛固定4～8h。随后标本用10% EDTA处理4周后，冲洗、烘干、凝胶固定标本后取出标本，备切片染色。取每组6只大鼠的关节软骨，-80℃保存备用，用于RT-qPCR等分析。

1.5 总RNAs提取利用TRIzol（Invitrogen carlsbad，CA）法提取总RNAs完成。将颞下颌关节中的关节软骨完全分离出来，立即加入液氮研磨成粉，再加入1mL TRIzol试剂。然后依次加入氯仿、异戊醇、70%酒精沉淀RNA。最后通过Nanodrop 2000检测RNAs浓度和质量。

1.6 RT-qPCR检测相关因子表达 利用Takara公司的逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser and SYBR Premix Ex Taq（Takara，Dalian，China）进行逆转录的有机化学反应。每个样本提取1μg总RNA用于逆转录。使用荧光定量PCR的方法对Col-2、Acan的基因表达量进行检测，数据内参选择GAPDH。通过比较Ct值法（2-△△Ct法）计算各基因表达量的平均值，利用内参将数据的平均值标准化。所计算得到的平均值数据以平均值±标准差表示。

1.7 组织形态学染色H&E染色采用切片机得到4-5μm切片，贴附于载玻片上，置60℃干燥箱中烘烤2h，然后将切片脱蜡水化，依次将切片放入二甲苯、无水乙醇、85%酒精、75%酒精、蒸馏水。然后将切片放入苏木精染液中浸泡5min左右，流动自来水冲洗切片，使用1%的酒精和盐酸乙醇分化10s，稍后用水洗，促蓝液返蓝，流水冲洗5min。伊红染色后中性树胶进行脱水封片，将切片依次放入95%酒精、无水乙醇、二甲苯，干燥后中性树胶封片。

1.8 统计学分析 所有统计分析采用SPSS17.0软件，计量数据资料组间比较采用单因素方差分析；对于所有符合正态分布的计量数据资料采用x±s表示，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2.结果

所有实验动物在观察期内均健康存活，无伤口感染等手术并发症发生。动物咀嚼功能正常，在实验观察期内，动物体重都呈不同程度的持续稳定增加。

2.1 大鼠体重变化 各组大鼠体重及进食饲料量测量实验前每只大鼠的体重均在250～300g之间，实验周期结束处死前称重，空白组大鼠体重平均增加13.99g。与空白组相比，对照组和实验组大鼠的正常体重均显著增加。与对照组相比，实验组大鼠平均体重增加显著（见图1）。

图1 不同组大鼠体重增加量。空白组平均体重增加13.99g，对照组体重增加87.84g，实验组体重增加126.47 g。实验组vs空白组，P＜0.001；实验组vs对照组，P＜0.001；对照组vs空白组，P＜0.001

实验周期内对三组大鼠的饲料重量进行承重，累加，其中空白组在实验周期内共计进食饲料2570g，对照组3350g，实验组3520g，其中实验组大鼠进食量最高。（见图2）。

图2 不同组大鼠进食量

2.2 关节液中相关炎症因子的检测 抽取每只大鼠颞下颌关节腔中50μL关节液。其中空白组10只大鼠关节液中蛋白含量为3.19±1.09mg/mL，对照组10只大鼠关节液蛋白含量为3.99±2.29mg/mL，实验组10只大鼠关节液蛋白含量为3.09±1.76mg/mL，三组之间蛋白含量均无显著差异（图3A）。我们进一步分别检测3组大鼠关节液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的水平。与空白组相比，对照组和实验组的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著降低，表明经过适当的处理后，病情炎症得到控制。与对照组相比，实验组大鼠的IL-6，IL-8水平显著降低，差异有统计学意义，而TNF-α水平降低无任何统计学意义。

表1 关节软骨合成与分解代谢中各因子的引物

图3 TMJ总蛋白及炎症因子检测。A：总蛋白含量，B：IL-1β蛋白含量，C：IL-6蛋白含量，D：IL-8蛋白含量，E：TNF-α蛋白含量。

2.3 RT-qPCRⅡ型胶原蛋白（Col-2）和蛋白聚糖（Acan）是软骨细胞细胞外基质的主要成分，在软骨的形成过程中是必不可少的，本实验结果显示实验组和对照组中Col-2和Acan的mRNA的表达水平显著提高。此外，实验组中Col-2和Acan的mRNA表达高于对照组，但无显著性差异（图4）。

2.4 H&E检测 在注射卡拉胶后，空白组、对照组和实验组均出现了不同程度的滑膜炎病理改变。从大鼠的注射侧颞下颌关节标本纵切片H&E染色样本中分析可见：空白组中大鼠颞下颌关节软骨变薄，且关节组织结构、层次变得紊乱，软骨层和软骨细胞几乎完全消失，滑膜组织出现严重增厚、折叠样改变，颞下颌关节软骨及毗邻组织可见局部炎性细胞浸润。而对照组和实验组的关节表面表现出轻微的不规则结构改变，关节软骨层轻度增厚，并且与正常软骨层厚度相比，软骨细胞数量，明显增加，呈簇状聚集式分布，而颞下颌关节及毗邻组织局部未见炎性细胞浸润（图5）。

图4 Col-2和Acan基因表达检测

图5 关节腔内注射药剂7周后的组织学表现。A：空白组，滑膜严重增厚、出现折叠样改变（×10 ）；B：实验组：关节表面表现出轻微的不规则改变，关节软骨增厚，软骨细胞的数量增加，呈簇状聚集分布（×10 ）；C：空白组附近组织可见炎性细胞浸润（×100 ）；D：实验组附近组织未见炎性细胞浸润（×100 ）

3.讨论

颞下颌关节（Temporomandibular Joint，TMJ）结构只存在于哺乳动物中，参与具有咀嚼、吞咽、语言和表情等多种功能的活动［9］。颞下颌关节滑膜炎发生后往往首先引起患者出现的是颞部疼痛，可能还伴有头晕、耳鸣等症状［10］。TMJ滑膜是TMJ滑动运动体系中的重要组成部分之一，是一层薄而柔软、光滑的疏松结缔组织，衬于关节囊内表面，覆盖于关节盘之上，其边缘附着于颞下颌关节软骨的外周缘，将整个关节腔包绕形成一个密闭的关节囊结构［11］。这些滑膜既能分泌滑液以润滑关节，减少与关节表面的摩擦，防止关节表面的粘连，同时又能为关节软骨组织提供足够的营养成分及帮助排泄废物等［12］。TMJ滑膜及关节囊的炎症反应与TMD的关节炎症病生理变化过程有着直接的联系，主要引起包括急、慢性TMJ滑膜炎、TMJ关节囊炎等疾病。此外，TMJ炎症通常还会伴有颞下颌关节盘移位、骨关节病以及骨关节炎。

TMJ滑膜炎是临床上常见的一种慢性口腔颌面部关节疾病，是TMJ紊乱病的一个重要亚类，是老年人口腔疾病中的一种常见病、多发病，仅次于牙周病、龋病［13］。TMJ滑膜炎在临床上主要包括滑膜炎和关节囊炎两大类。滑膜炎一般是指滑膜在创伤、感染、骨质增生、关节退行性变、手术等各种状况下发生的炎性化学反应，使滑膜细胞正常的分泌功能失调从而导致关节积液的一种关节局部性病变。其临床症状表现为随关节功能性活动以及向上、后方向的活动关节受到负重压力而出现加重的关节局部性疼痛，严重影响患者的工作和日常生活，令患者十分痛苦。迄今为止，临床上对于关节炎的治疗虽然种类繁多［14］，却仍然没有找到一种安全有效、操作简便、价格低廉的治疗方法。此外，关节炎的发生机制也鲜有报道［15］。

Horton首次采用关节腔内注射氢化可的松治疗颞下颌关节疼痛，随后，关节腔内注射糖皮质激素逐渐成为临床上治疗颞下颌关节疼痛的一种常用方法［16］。其作用机制主要是抗炎和免疫抑制。而近年来的临床研究进一步证明，关节腔内进行注射糖皮质激素可能直接诱发关节相关组织如关节盘、软骨以及髁突的损失和破坏。因此，临床上逐渐使用透明质酸钠等药物替代激素注射进行治疗［15，17］。透明质酸存在于关节液及软骨基质中，是重要的组成成分之一，能够有效在关节腔内起到润滑作用、并维持关节液的黏性和流动性，同时能够参与细胞外基质中磷酸电解质及其水分调节，具有提供营养软骨参与促进软骨组织修复等多种重要生理功能。由于透明质酸在保护、营养关节方面发挥着重要作用，后来被越来越广泛地应用于关节腔注射，与此同时关节腔内注射透明质酸后引发的治疗后关节腔黏连也逐渐引起了广大口腔医生及学者的注意［18，19］。迄今为止，在用于关节腔注射的主要药物研究和选择中，始终未能发现一种既能补充营养、润滑关节，又能对机体无不良反应产生的理想药物。几丁糖是由甲壳动物外壳中提取的一种高分子化合物，可被体内细胞存在的溶酶菌等其他化学物质降解成低分子壳寡糖和高分子葡萄糖胺。壳寡糖对机体具有良好的免疫调节、广谱抑菌、抑制成纤维细胞生长、促进上皮细胞生长等多种生物学特性。所以本法不良反应小，易于临床操作［20］。目前，临床上已广泛应用于关节、盆腔、腹腔、肌腱及神经手术中，可有效预防术后组织粘连，促进术后止血和创面愈合，促进关节软骨修复［21］。目前几丁糖在大关节疾病的治疗中已得到广泛应用，但是鉴于颞下颌关节解剖结构及发病病因的复杂性，几丁糖在颞下颌关节中的治疗效果及机制仍有待深入研究。随着颞下颌疾病，特别是颞下颌关节滑膜炎的患病率在临床诊疗中不断攀升，颞下颌疾病的治疗也逐渐引起越来越多学者、医生以及广大患者的重视。

目前动物实验中被研究人员普遍接受的大鼠颞下颌关节滑膜炎建模方法有以下几种：方法一是改变大鼠前牙咬合［22］，方法二是外科手术损伤大鼠颞下颌关节滑膜［23］，方法三是大鼠关节腔注射药物，常用卡拉胶［8］。以上三种方法在科研中具有广泛的应用，方法一中在大鼠上前牙粘接具有一定形态的金属冠来改变大鼠咬合，同时也影响大鼠的正常咀嚼；方法二中在使用外科方法损伤大鼠滑膜时，由于大鼠颞下颌关节区较小，外科损伤往往不只损伤滑膜，滑膜下软骨，甚至骨组织亦损伤，本实验中旨在讨论关节滑膜炎，不牵涉骨关节炎，综上所述，本研究选择卡拉胶关节腔注射方法用以建立大鼠颞下颌关节滑膜炎模型，操作简单，并且已排除干扰实验结果的其他变量。本研究在成功构建大鼠TMJ滑膜炎模型后，分别向对照组和实验组注射透明质酸和几丁糖，空白组只进行关节腔穿刺，不注射药物。与对照组相比，实验组大鼠进食量较大，体重显著增加，几丁糖和透明质酸均可以降低IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平。从进食量及体重水平可以发现，经过药物注射治疗后的大鼠具有更大的进食欲望，说明对照组与实验组大鼠的TMJ滑膜炎症状较空白组改善，同时相关炎症因子的表达水平在两治疗组中均表达下调。对照组与实验组对比，实验组中IL-6的表达情况比对照组明显下调，而IL-1β、IL-8及TNF-α表达水平并无统计学差异。IL-6是TMD发病过程中的主要促炎细胞因子，在炎症过程与TMJ结构破坏之间的联系已被阐明［24，25］。IL-6是急性炎症向慢性转化的必需元素，在炎症发生发展过程中具有双重影响。有学者研究发现［26］，在人类TMJ患者中IL-6血浆浓度可在组织损伤发生后60分钟内确定，峰值范围为4至6小时至10天。我们对大鼠取材时间在第四周，已经超过IL-6的表达峰值时间，因此两治疗组IL-6的表达水平已经明显下降，说明两种药物对TMJ滑膜炎均具有一定的治疗作用。而实验组具有更低的IL-6表达水平，说明与透明质酸钠对比，几丁糖能更好地减轻炎症因子对TMJ的影响。IL-8在TMJ疾病的发病机理中也具有一定功能［27］，几丁糖也可以有效降低关节液中IL-8的水平。TNF-α是炎症阶段早期即升高的细胞因子，可以影响许多炎症介质的产生［28，29］，IL-1β则具有促炎作用［30］。由于取材时间为第4周取材，治疗组大鼠滑膜炎可能已被治愈，引起炎症反应的前期炎症因子表达已不明显。

两个治疗组Col-2和Acan的基因表达水平高于对照组。在对关节软骨组织结构学的临床观察中可以发现，对照组和实验组大鼠的注射侧关节表面仅表现出轻微的不规则的组织结构改变，关节软骨明显增厚，并且与正常关节软骨相比，软骨细胞的数量增加，呈簇状聚集分布，而颞下颌关节及毗邻组织未见炎性细胞浸润。这说明，在第4周的时候，两种药物均能成功改善大鼠TMJ滑膜炎症状并能保护关节软骨不被破坏。我们的实验结果证实，几丁糖与透明质酸钠疗效类似，在第四周时均能治愈大鼠TMJ滑膜炎。但是由于取材时间偏晚，实验观测时间点不足，我们未能在治疗全过程中观测两种药物的治疗效果。

综上所述，本实验进一步证实了几丁糖注射治疗可有效地降低大鼠颞下颌关节滑膜炎模型中的IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的表达水平，与透明质酸钠的治疗效果对比，其能更好地减低IL-6，IL-8炎症因子的表达水平。然而，由于颞下颌关节滑膜炎疾病自身的复杂性，同时几丁糖用于治疗大鼠颞下颌关节滑膜炎的作用机制以及长期疗效尚不明确，我们将继续致力于颞下颌关节滑膜炎可能的发病机制的研究，并进一步探讨几丁糖用于人颞下颌关节治疗的长期疗效。