三维细胞培养在肺癌中的研究进展

所元东 黄云超 黄永平 张立人 孙卓琛 李炫呈 周 晨 杨政鸿

云南省肿瘤医院 昆明医科大学第三附属医院胸外一科,云南昆明 650118

全球大部分国家中，肺癌的发病率和死亡率均排在首位。据2018年全球癌症统计报告，有210万例新肺癌病例和180万例死亡，占癌症死亡人数的近五分之一（18.4%）[1]。80%以上的患者为肺癌晚期（Ⅲ期、Ⅳ期），只能采用化疗、放疗和姑息疗法等治疗方法[2]。因此，全面了解肺癌的微环境、增殖、转移、耐药以及复发等相关分子机制是治疗肺癌的关键。体外模型是研究肿瘤分子机制和药物筛选的重要工具，用于肺癌体外研究的模型主要包括二维细胞模型和动物模型。二维细胞培养是通过细胞黏附在塑料或玻璃培养基等固体平面上形成的，具有可重复性高、成本低等优点，在新型抗癌药物的研发方面具有优势[3-4]。但是，与体内肿瘤细胞生存环境相比，忽视了氧气、营养、药物浓度梯度的影响，限制了细胞-细胞与细胞-细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的相互作用[4]。动物模型也存在一定局限性，如缺乏人体内复杂的分子转化机制、肿瘤微环境（tumor environment，TME）与人体内存在差异、生长速度快于原发肿瘤等。二维细胞培养模型和动物模型的不足导致药物研发具有较低的临床转化率，在三期临床实验中显示出疗效的药物，只有5%能应用于临床，造成较低临床转化的主要原因是没有选择合适的临床前模型[5]。逐渐成熟的三维细胞培养（three-dimensional cell culture，3DCC）模型正好可以弥补二维细胞培养模型和动物模型的劣势，能较好地模拟人体内肿瘤细胞的生长、增殖、分化和转移，可以构建类似体内环境的TME，在抗癌药物的开发和筛选、耐药机制等方面具有较好的应用前景。

3DCC在研究癌细胞的生长、增殖、分化、转移及TME等方面显现出明显优势。用于构建三维细胞培养的方法越来越趋于成熟，如悬浮培养、微流体、基于支架的水凝胶以及磁流体和生物印刷等，各种方法已经在相关研究中使用广泛[6]。据统计，采用三维细胞培养技术培养癌细胞的研究占到35%，接近所有细胞种类的三分之一[7]。截至目前，3DCC技术在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及卵巢癌中已被广泛应用[4]。但应用于肺癌相关的研究较少，本文拟对三维培养技术在肺癌研究中的应用做一综述，评价其应用价值及优势，促进三维细胞培养技术应用于肺癌及其相关研究[7]。

1 肺癌细胞在二维培养与三维培养下的生物学行为差异

三维培养与二维培养在细胞增殖、细胞形态以及蛋白表达等方面具有明显差异。非小细胞肺癌95D细胞在三维打印支架培养形成三维模型，在细胞形态上，细胞以大小不等的球形态分布在支架上，类似于肺内弥散性转移，还可观察到分叶、毛刺、结节等形态学特征；而二维培养的同类型细胞在培养基板面上呈梭性展开，只有伪足形成[8-9]。王珊珊[10]比较了二维和三维培养人肺腺癌细胞系A549的差异，二维培养的A549贴壁生长，呈不规则状，三维培养则呈球状生长。

在增殖能力方面，培养初期三维培养细胞增殖速率明显慢于二维培养，培养至8～9 d时，增殖速度加快，超过二维培养，整个过程中，三维培养可以保持更长的增殖时间[9]。将二维和三维培养的人肺腺癌A549分别接种在Scid裸鼠体内，三维培养组小鼠肿瘤生长至1 cm所需时间明显少于二维培养组，生长速度也快于二维培养组，接种20 d后肿瘤体积明显大于二维培养组[11]。

在蛋白表达方面，三维培养中基质金属蛋白酶 -2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）蛋白高表达，明显高于二维培养，可能是因为MMP-2的分泌需要微环境的刺激，而二维培养中缺乏肿瘤微环境[9，12]。闫江涛等[8]也得出相似结论，三维共培养的非小细胞肺癌GLC-82细胞与人胚肺成纤维细胞可以明显上调MMP-1、MMP-2、MMP-9等蛋白，进而促进肿瘤的侵袭转移。因此，TME与肿瘤细胞间的相互作用在癌症的侵袭、增殖、转移及耐药等研究中是不能忽视的。非小细胞肺癌H460细胞系的3D聚集体，与二维培养的蛋白质表达谱也存在明显差异，但蛋白质分子量与人体内肺癌对应蛋白是相匹配的。与二维培养相比，其中RET、MET、MEK1、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM7、CEACAM18-21表达增加；EGFR、BRAF、CEACAM6、CEACAM16表达下降；甚至还存在部分蛋白表达缺失，如 ROS、HER2、ALK、PIK3CA、CEACAM5和CEACAM8，这些蛋白在培养早期（4 d）呈低表达，在8 d后表达缺失[13]。肺腺癌细胞A549细胞中的肺癌干细胞（lung cancer stem cells，LCSC）三维培养也发现FGF1和IGF1的表达和分泌水平显著提高[14]。I型胶原（collagen I）在三维培养的肺癌细胞KYSE510和KYSE140的也出现表达下降[15]。

可见，三维培养在细胞增殖、细胞形态方面均优于二维培养，与体内肿瘤生长方式更为接近。肿瘤微环境在肿瘤增殖、侵袭和转移、化疗耐药等方面具有重要作用[16]，三维培养能够模拟细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用，可作为一种较优的体外模型[17-18]。三维培养在不同的培养时期，蛋白表达的种类和量都会产生变化，可能与肿瘤微环境密切相关，这有助于研究肿瘤动态发展和耐药性产生的分子机制。

2 三维培养技术在肺癌化疗中的应用

三维细胞培养技术构建的肿瘤细胞立体结构，对于氧气、营养、药物等成分存在浓度梯度，细胞吸收药物的方式和浓度更接近体内，目前在药物筛选和耐药分析的研究中应用广泛。根据细胞种类可以将其分为单细胞三维培养和多细胞三维培养，单细胞培养主要用于研究药物直接对肿瘤细胞的影响，多细胞培养除了上述作用外，还可以研究细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间相互作用对药物的影响。

2.1 单细胞三维培养

人腺癌A549细胞形成的3D多层培养物，细胞呈层状堆叠，是3D肿瘤球体的等效替代品，给予多西他赛、长春碱、阿糖胞苷和甲氨蝶呤四种药物，治疗后A549细胞活力均保持在50%以上，而二维培养的细胞活力均小于50%。前者还检测到多重耐药蛋白（MRP1/ABCC1），治疗后其表达水平没有变化，说明A549细胞对4种药物没有产生耐药[19]。ROS1阳性的HCC78细胞系在吉兰糖胶条件下进行三维培养，使ROS1融合基因表达上调，分别给予克唑替尼和卡波替尼处理，结果显示：克唑替尼对ROS1 WT和D2033 N突变的HCC78细胞的IC50降低了30倍和2倍，而对ROS1 G2032R突变的IC50反而超过了血浆峰值水平；卡波替尼对ROS1 WT和D2033 N突变的HCC78细胞的IC50均比峰值血浆水平低约20倍。使用三维培养ROS1阳性的HCC78细胞可以作为检测ROS1突变和筛选其抑制剂的重要体外模型[20]。有研究利用肺癌患者的肿瘤组织培养形成3D肿瘤球体，与H1299肿瘤球体分别给予顺铂处理，培养72 h后IC50远高于二维培养[21]。肺癌细胞A549同样给予顺铂处理，培养48 h以及72 h后，三维培养组的细胞存活率也显著高于二维培养组，说明三维培养的细胞比二维培养具有更高的耐药性[11]。需要注意的是，患者来源3D肿瘤球体，取材前需要注意其是否进行过化疗或靶向治疗，否则肿瘤组织残留的药物可能会对结果产生影响。三维培养模型的药物吸收模式类似于体内细胞，肿瘤外部由于营养、氧气等含量高，代谢活性高，药物吸收浓度也随之升高；肿瘤内部由于营养、氧气等不足，代谢废物集聚，会引起细胞发生凋亡坏死，影响药物的吸收，这种药物分布差异会导致肿瘤的治疗效果不佳。因此，三维培养相较于二维培养，能够更有效地评估药物效果和有效剂量，对于指导肺癌的药物治疗更具价值。

2.2 多细胞三维培养

有研究将NSCLC细胞系NCI-H157、肺癌来源的成纤维细胞和单核细胞以1∶1∶1的比例进行3D共培养，经紫杉醇处理，共培养物有80%的代谢活性，相较于单培养，对紫杉醇显示出更低的敏感性。顺铂处理后，单培养和共培养的代谢活性没有明显差异。根据顺铂的作用机制，其不受TME的影响，可以引起细胞普遍凋亡[22]。则造成两种药物处理结果不同的原因可能是肺癌来源的成纤维细胞和单核细胞改变了癌细胞对紫杉醇的敏感性。成纤维细胞和单核细胞来源于肺癌的微环境，说明TME能够影响药物对细胞的治疗效果，是在药物筛选和耐药分析中不能忽视的重要因素之一。

3 三维培养技术在肺癌放疗中的应用

肺癌放射治疗中，肿瘤组织的氧含量及微环境改变是影响放疗效果的重要因素。相关研究表明氧气分压低于25～30 mmHg时，放疗敏感性会迅速降低[23-24]。三维培养模型，相较于其他体外模型，在模拟氧气、营养等梯度具有巨大优势。

将A549细胞嵌入含有水凝胶的纸张，将纸张堆叠呈肿瘤组织样3D结构，共6层（L1～L6），氧气和营养逐层降低，和体内情况类似。给予8 Gy辐射处理，层辐射区域与未辐射区域的细胞代谢活性存在较大差异。L1和L2的代谢活性下降了35%～59%；L3降低了17%～52%；L4和L5也下降，但无统计学意义；L6未检测出。此外，L1到L6缺氧标志物缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 和 碳 酸 酐 酶 9（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）表达增加；对应的L1细胞增殖最高，L6最低。结果表明细胞增殖会随着氧气浓度减少而下降，使得细胞对放疗的敏感性也在逐层下降[25]。三维细胞培养技术用于肺癌的相关研究太少，还需要大量数据才能说明其在放疗中的优势。

4 三维培养技术构建可用于长期研究的肺癌细胞系

Zhang等[21]利用来源于肺癌患者肿瘤组织中的原代细胞，在补充有1%FBS，10%N-2，200 ng/ml Noggin的Advanced DMEM/F-12培养基中培养，连续培养了120 d后，HE染色显示与原始肿瘤组织无差异。将其在液氮中冷冻一段时间，解冻后细胞活力仍保持在90%以上。LIU等[14]证实了FGF1和IGF1可以显著促进A549-3D中肺癌干细胞的增殖，同时抑制其凋亡。并利用此特性，在RPMI-1640完全培养基中加入20 ng/ml FGF1和50 ng/ml IGF1培养A549细胞的肺癌干细胞，在长期研究中可作为一种潜在的细胞系。与二维培养相比，三维培养可以达到4周以上[7]。建立用于长期研究的细胞系有利于对肿瘤转移及耐药形成过程进行长期与连续的观察，深入了解相关机制。

5 总结

与二维培养相比，三维培养在肿瘤细胞的生存能力、形态、增殖、迁移、基因蛋白表达以及细胞间相互作用等方面具有优势。利用三维培养技术在体外培养肿瘤球体，可以模拟体内肿瘤形成脉管系统、低氧区域、药物吸收差异以及较低的增殖率，同时，三维培养的肿瘤细胞具有更好的稳定性，可培养4周以上甚至更长的时间，能够用于肿瘤的长期研究和动态研究。此外，还可以加入肿瘤微环境中的物质或细胞进行三维共培养，研究细胞-基质、细胞-细胞之间的作用机制，这是二维培养技术所不具备的[6-7，26]。在三维培养的肿瘤细胞中，蛋白质的表达随着培养时间而发生变化，这可能与肿瘤微环境改变或药物作用等因素引起肿瘤细胞相关基因改变所导致的[10，27]。最后，三维细胞培养具有高保真性。三维培养的细胞几乎整个表面都暴露于微环境或其他细胞，而二维培养的细胞只有接近一半的表面暴露于液体，一半暴露于培养基表面或中间，只有小部分表面与其他细胞接触。三维细胞培养存在氧气、营养和代谢产物，可以引起不同层级细胞的增殖和分化差异，并导致不同层级细胞对药物的敏感度不同。因此，三维细胞培养能更好地模拟体内的TME及细胞-细胞和细胞-细胞外基质之间的相互作用[7，28]。

三维培养技术的应用还有一些局限性：①培养初期，细胞增殖速率低，不及二维培养，可能需要更长的培养周期；②基于支架的三维模型构建需要较高的成本，但应用悬滴技术或生物容器等制备也不需要较高的成本；③不同批次的三维支架具有较低的重复性[7]。利用三维细胞培养模拟体内肿瘤生长的特点，可以改善药物的临床转化率，对于肿瘤侵袭转移、耐药机制等研究具有优势，是目前细胞培养技术发展的趋势。

6 展望

运用三维培养技术构建的3D细胞结构，可以实现细胞-细胞与细胞-细胞外基质之间的相互作用，形成氧气、营养、代谢产物以及药物浓度梯度，能够模拟肿瘤细胞在体内的增殖、分化、转移、血管形成以及肿瘤微环境等多个过程，在肿瘤药物筛选和耐药机制研究中显示出巨大潜力。总体上，三维培养技术在肺癌中的应用并不成熟。查阅相关数据库发现，三维培养技术应用于肺癌细胞的研究较少，相关研究基本上处于探索阶段。后续还需要更多的基础研究为其搭建理论基础，下一步建立相关临床研究，证实其在药物筛选、耐药机制等方面的应用价值。