酪氨酸蛋白激酶Lyn对内质网应激的调节在慢性阻塞性肺疾病发病机制中的作用

吴礼婷 伍清华 彭 芳 洪 玮

1.广州医科大学第三临床学院，广东广州 511436；2.广州医科大学附属第三医院ICU科，广东广州 511436；3.广州医科大学生命科学学院，广东广州 511436

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以小气道呼气受阻为主要特征的慢性进行性疾病，主要病理特征为慢性支气管炎（气道损伤、重塑）和肺气肿（肺组织弹力纤维破坏）。COPD的发病机制与炎症细胞密切相关，如巨噬细胞、中性粒细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CD8+T细胞）等。另外，还与蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡、氧化应激、自身免疫机制及细胞衰老等有关。研究发现，凋亡使肺的组织结构细胞破坏程度远远大于其自身的正常生长，从而促进了COPD的发生发展[1-3]。凋亡学说对肺泡间隔的结构细胞和肺血管内皮细胞的影响，参与了肺气肿的发病机制，其中尤以肺泡上皮细胞的凋亡致肺气肿形成备受关注[4-5]。

研究发现，严重的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）能够诱导肺上皮细胞的凋亡，这是目前COPD发病机制研究的重要内容[6]。ERS发生的关键因子葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），在有害刺激程度较轻时可以对肺组织结构细胞起到一定的保护作用，当有害刺激程度加重或持续时间较长时，GRP78对肺组织结构细胞的保护作用丧失，该因子下游的ERS致细胞凋亡的相关通路被激活，细胞凋亡程序启动，最终引起内质网应激特异凋亡分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白-12（cysteinyl aspartatespecific proteinase-12，caspase-12）和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/C/EBP homologous protein，CHOP）表达增加，诱导细胞凋亡[7-9]。有研究表明，PI3K/Akt通路能够通过对抑制生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白153（growth arrest and DNA damage-inducible gene153，GADD153）的诱导，从而对ERS细胞起保护作用[10]。PI3K/Akt通路也可通过对ERS诱导GRP78表达增加发挥保护作用。研究表明，配体酪氨酸激酶受体系统是PI3K/Akt通路的激活剂[11]。Lyn激酶是非受体酪氨酸激酶Src家族成员，Lyn激酶在调节细胞的增殖、分化、凋亡、迁移、代谢与免疫反应等过程中起着重要的作用。此外，Lyn激酶与多种信号途径相关联，在很多组织细胞中有正向或负向的调节作用[12-14]。有研究表明，在肺功能的危重症COPD患者中均可检测到Lyn基因的出现，但与Lyn激酶在COPD的发生发展中的机制相关的报道较少[15]。体内缺乏Lyn激酶的小鼠（Lyn -/-小鼠）表现出显著升高的白细胞介素-17（interlukin-17，IL-17）和干扰素γ（interferon gama，IFN-γ）[16]。IL-17是记忆T细胞分泌的前炎症因子，与多种炎症反应和自身免疫反应相关，可以促进气道阻塞的发生和诱导COPD急性加重，导致肺气肿的发生和发展[17]。探讨Lyn激酶对COPD发生过程中的作用及其机制，对于寻找COPD治疗新靶点及新型药物有重要意义。本文将探讨Lyn激酶通过PI3K/Akt通路对内质网应激途径对炎症因子IL-17的调节在COPD发病机制中的作用。

1 内质网应激过度引起细胞凋亡的发生

细胞结构与功能的正常维持与很多机体环境因素有关，包括营养不良、糖基化修饰作用的改变、缺血再灌注损伤、钙缺乏、氧化应激、DNA损伤和能量不足等情况[18]。生理性蛋白质折叠量增加，导致细胞内质网合成蛋白质的功能紊乱，出现大量的蛋白质折叠错误，错误折叠的蛋白质积聚在内质网腔中，即为ERS。当应激发生后，ERS的关键因子GRP78表达上调，蛋白质合成被抑制、错误折叠和未折叠蛋白质加速降解，从而使细胞内质网负荷工作得以缓解，可暂缓ERS[19]。当ERS异常时，会导致未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的发生，从而保护细胞。UPR的下游有三种跨膜蛋白，即蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase， PERK）、肌醇激酶1（inositol-requiring enzyme-1，IRE-1）和活化转录因子6（activating transcription factor 6， ATF6）[20]。在细胞生理功能正常时，这三种跨膜蛋白处于无活性状态，分别与GRP78结合。当出现ERS时，上述3种蛋白质与GRP78解离，与未折叠蛋白结合从而启动UPR。UPR启动后，PERK、IRE-1、ATF6与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，从而使在内质网内堆积的未折叠或错误折叠的蛋白质减少，使其负荷减轻并恢复正常功能，对细胞起到保护作用[21]。严重的刺激引起程度过强或持续时间过长的ERS反应时，损伤超过修复能力，UPR不能启动，PERK、ATF6和IRE-1未折叠或错误折叠的蛋白质的结合量远远小于内质网内堆积的未折叠或错误折叠的蛋白质，此时PERK、ATF6和IRE-1会启动凋亡机制，诱导细胞凋亡。与之相应凋亡机制包括：①DNA损伤诱导基因153（GIDD153）的激活转录；②C.Jun氨基酸末端激酶（C-Jun N.terminalkinase）通路的激活；③内质网特有的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的激活等。内质网应激时PERK/eIF2、ATF6和IREl/XBP1信号途径均被激活，并且诱导CHOP的表达。CHOP基因抑制转录因子C/EBP和内质网氨基肽酶1（ERAP1）的表达，可抑制细胞周期过程中从G1到S期的转换。CHOP在内质网应激时可以介导GADD34和内质网氧化物蛋白（endoplasmic oxidoreductin 1 like protein，Ero-Lα）的激活与表达。GADD34可以使真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化真核启动因子2α抗体（Ser51）去磷酸eIF2α的Ser51去磷酸化，刺激蛋白的合成。Ero-Lα可以引起氧化应激的发生，从而促进细胞凋亡。细胞中缺乏CHOP时，细胞凋亡下降，CHOP过表达则能促进细胞凋亡，CHOP在ERS诱导的细胞凋亡中发挥促凋亡作用。J-NK的激活通路可以通过多条途径诱导细胞凋亡。吸烟可通过内质网应激下游PERK/eIF2/CHOP信号通路促进CHOP表达，启动细胞凋亡。而ERS的下游PI3K/Akt信号通路则对内质网应激细胞起保护作用，从而促进COPD的发生与发展。

2 内质网应激的下游PI3K-Akt信号通路对内质网应激细胞起保护作用

PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，它可使肌醇环第3位羟基磷酸化。此外，其本身也具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。PI3K的构象改变和其与某些因子结合会使其激活。其激活方式如下：①与含有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而被激活。②通过原癌基因c-ras表达的产物Ras和催化亚基p110直接结合导致PI3K的活化。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PI3K可以使Akt活化。有活性的Akt可以诱导各种编码抗凋亡蛋白基因表达或发生信号偶联而抑制细胞凋亡发生，进而促进细胞生成[22]。当细胞外没有刺激信号时，p85调节亚基与p110催化亚基与PI3K结合，此时的PI3K没有活性，当机体损伤致缺血在灌注损伤、钙缺乏、氧化应激、DNA损伤和能量不足等情况时，调节亚基p85与催化亚基p110之间的相互作用受抑制，随后PI3K/Akt通路激活，活化的Akt通过磷酸化作用于一系列细胞内蛋白从而介导下游反应[23]。ERS过度会导致细胞凋亡，PI3K/Akt通路可能对ERS存在负调节作用。有研究表明，PI3K/Akt通路能够通过对GADD153的诱导，对内质网应激细胞起保护作用[10]。另外，PI3K/Akt通路也可通过对ERS诱导GRP78表达增加中发挥保护作用[24]。细胞处于生理状态下时，GRP78的表达水平较低，当各种刺激引起内质网应激时，GRP78的表达量会显著增加，表现出保护细胞受损的功能[25]。研究表明当P13K/Akt信号通路激活受阻时，ERS引起的GRP78表达显著下降，而上调P13K/Akt信号通路活性时则诱导GRP78表达，PI3K/Akt通路通过抑制蛋白酶体，使GRP78蛋白降解，稳定性增加，发挥调控作用[26]。

3 Lyn激酶是PI3K/Akt通路的激活剂

Lyn激酶是Src家族成员之一，是一类非受体型蛋白酪氨酸激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。Lyn激酶的N末端有独特的结构域、SH3结构域、SH2结构域，C末端有一个保守酪氨酸磷酸化位点，主要通过其N末端与细胞膜表面蛋白的胞浆内结构域相连接，从而发挥信号转导作用。Lyn激酶与其他Src家族激酶成员一样通过其N末端SH2/SH3结构域以及磷酸化状态调节蛋白质相互作用[27]。Lyn激酶可通过多种信号途径参与气道重塑和炎症反应，具有双向调节细胞信号的作用。细胞内缺乏Lyn激酶，可引起气道高反应、气道炎症及气道重塑的发生。研究表明，配体酪氨酸激酶受体系统是PI3K/Akt通路的激活剂[28]。PI3K不仅具有Ser/Thr激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。PI3K可分为3类，其结构与功能不同。I类PI3K含有1个调节亚基和一个催化亚基，为异源二聚体，调节亚基通常称为p85，含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。Lyn激酶的N基末端含有与之相应结合SH2和SH3结构域结合位点，表明Lyn激酶可诱导PI3-K/Akt通路激活。

4 Lyn激酶缺乏诱导IL-17显著增加

IL-17可介导多种炎症反应和自身免疫反应，COPD多表现为气道的慢性炎症，IL-17在COPD发生的炎症过程中起重要作用[29]。IL-17参与COPD肺气肿表型的发生机制尚不清楚。IL-17可以特异性地和选择性地将嗜中性粒细胞募集到气道中，IL-17对气道上皮中黏蛋白基因表达的影响与黏液产生增加有关。COPD的病理表现特征为气道炎症和黏液分泌过多，黏液分泌过多是COPD的病理生理变化之一，IL-17可能在COPD的发展中起重要作用。在吸入卵白蛋白（OVA）的小鼠中，抗IL-17抗体对IL-17活性的抑制显著降低了气道炎症细胞数量的增加，IL-17可能在小鼠中香烟烟雾诱导的COPD中的气道中性粒细胞炎症中起关键作用。有研究表明，Lyn -/-小鼠对DSS诱导的结肠炎易感性与结肠T细胞对IL-17和IFN-γ的过度产生有关。与空白对照小鼠相比，免疫活性的Lyn -/-小鼠表现出显著升高的IL-17和IFN-γ。因此，受共生微生物群影响的肠T细胞群的稳态调节可使Lyn -/-小鼠易于对由IL-17和（或）IFN-γ产生驱动的炎性疾病敏感。从最初的Lyn -/-菌落到已经重新获得的Lyn -/-小鼠的微生物均可检测到IFN-γ（+）CD4+和CD8+T细胞以及IL-17的显著增加。这些数据表明Lyn的缺乏足以诱导T细胞产生的IL-17和IFN-γ增加[30]。Lyn激酶缺乏诱导增多的IL-17在COPD发生机制中有重要作用。PI3K/Akt通路也能够通过对GADD153的诱导，对ERS细胞起保护作用。Lyn激酶缺乏一方面可能诱导T细胞产生的IL-17增加，增加的IL-17会引起肺内中性粒细胞的募集，引起持续炎症反应从而加重COPD的慢性炎症过程。另一方面Lyn激酶缺乏使ERS下游PI3K/Akt通路不能激活，PI3K/Akt通路对细胞的保护作用不能发挥，细胞发生凋亡，中性粒细胞在极性化和趋化过程受阻，中性粒细胞的免疫防御能力下降均加重COPD的发生发展。

综上所述，Lyn激酶缺乏在IL-17高表达的情况下可能抑制PI3K/Akt通路的激活，而激活的PI3K/Akt通路主要通过诱导内质网应激中的GRP78分子表达发挥保护作用。PI3K/Akt通路也能够通过对GADD153的诱导，对ERS细胞起保护作用。当ERS持续存在情况下，内质网应激过度，ERS下游对细胞的保护通路PI3K/Akt通路不能激活，最终导致细胞凋亡。此外，PI3K/Akt通路在中性粒细胞的极性化和趋化过程中起重要作用，中性粒细胞在此过程中往往表现出免疫防御反应，对COPD病情有一定缓解作用。PI3K/Akt通路不能激活，中性粒细胞在极性化和趋化过程受阻，以及IL-17高表达时，肺内中性粒细胞募集活化，爆发了一系列炎症反应，进一步促进了COPD的发生发展。