液体活检在肝癌中的研究进展

陈 静 任少平 吴志全

肝细胞肝癌（HCC）简称肝癌，是严重威胁我国人民群众生命健康的恶性肿瘤，占我国恶性肿瘤死亡率的第2 位，我国是肝癌大国，肝癌发病率位列全世界第5 位，死亡原因位列第3 位[1]，它具有起病隐匿，手术切除率低，易早期转移和复发的特点。虽然经过多年研究，诊断及治疗水平有了很大提高，但复发转移率仍较高，因此，采取更加精准、简易、有效的方法，成为临床工作中迫切需要解决的课题。近年来，随着肝癌细胞研究的深入和生物学技术的提高，液体活检技术成为肝癌研究的一个热点。液体活检是将人体体液（尿液、胸水、腹水等）或者血液中的某些微小的成分（肿瘤细胞，肿瘤核酸或外泌体）通过特殊的方法进行浓缩、富集和鉴定，从而了解体液中具有肿瘤或基因特征的信息[2]。相对于组织活检而言，液体活检快速、安全、微创，因而患者依从性好，方便实时动态监测肿瘤细胞的变化，故而被认为是组织活检有效的补充[3]。

1 循环肿瘤细胞（CTCs）的生物学特性及检测方法

1869 年，澳大利亚病理科医生在乳腺癌死亡患者血中发现了与乳腺肿瘤形态相似的细胞，并命名为CTCs，但由于认识及分离技术等多方面原因，未能引起足够的重视[4]。CTCs 是肿瘤原发灶或转移灶释放入血或术中挤压肿瘤进入外周血，HCC-CTCs直径可达12～25μm，明显大于多数血液细胞，且多保留有肝癌细胞特异表型，这种存在于外周血液中的肿瘤细胞是肿瘤转移复发的一个主要途径。由于肿瘤细胞进入外周血液后，绝大部分被免疫细胞消灭，只有极少数存活下来，每百万血细胞中只有1～2 个，因此，在大量血细胞背景下富集和生物学鉴定是两大具有挑战的工作。富集极少量的CTCs 主要根据下列两种方法：基于CTCs 的物理特性（大小、密度、形状、电性等），或者生物学特性（细胞表面特异性标志物，肿瘤特异RNA 或者循环游离脱氧核糖核酸等），目前，检测肝癌患者CTCs 的方法较多，敏感性和特异性较强，检测方法主要有免疫荧光标记检测，RNA原位杂交检测和荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测3 种[5]，国内外使用较多的是Cellsearch 系统，它通过免疫磁性富集技术，准确性较高。

1.1CTCs 检测与肝癌的诊断问题 原发性肝癌的血清学诊断特异性方法只有甲胎蛋白（AFP）测定，但是仍有一定比例的假阳性和假阴性。在已经确诊的肝癌患者中，AFP 阴性者大约占30%，因此CTCs 检测在某些方面可能优于AFP。不同病期的肝癌患者，用不同方法检测外周血的阳性率都在50%以上，如果采用敏感性更高的检查方法，阳性率可达到80%以上[6-7]。舒叶菲和陈丽荣[5]应用流式细胞技术检测CD45、CD90 在肝癌患者血液中的分布情况，CTCs 检出率高达90%，而在对照的肝硬化患者和健康人群中，均无CTCs 检出，说明CTCs 在肝癌早期诊断中具有重要的意义。最新研究表明，肝癌临床分级与血液中CTCs 的数量呈显著正相关，因此，准确检出血液中CTCs 含量，直接影响患者临床分级[8-9]。马清等[10]在肝癌组（27 例）中CTCs 检测阳性22 例（阳性率81.5%），而AFP 阳性17 例，癌胚抗原阳性10 例，糖类抗原19-9 阳性11 例，CTCs 诊断肝癌的约登指数均高于三项肿瘤标志物检测，且CTCs 联合AFP 检测可提高肝癌的早期诊断率。在早期原发性肝癌，即直径＜3cm 的小肝癌诊断方面，影像学检查（CT、MRI）已经有了较高的诊断水平，但对不典型肝癌和直径＜1cm 的极早期肝癌，也有诊断困难和误诊的时候，而CTCs 检测有助于恶性肿瘤的鉴别诊断，假阳性率极低。利用生物学检测方法检出率较高，多种方法的联合应用可进一步提高。近期，Kalinich 等[11]报告用新开发第二代数字PCR 技术进行CTCs 检测，为肝癌提供了特异性和敏感性很高的检测手段。

1.2CTCs 在肝癌肝移植前的评估及术后复发预测中的作用 由于肝癌患者行肝移植后，较早发生移植肝的肿瘤转移，人们注意到这是否与患者移植术前的CTCs 阳性有关。冯锦城等[12]对42 例肝移植前影像学检查无肝外转移灶的患者，用cellsearch system 检测术前CTCs 并随访1 年，结果显示，肝移植前CTCs 阳性者29/42 例（69%），随访期间20 例复发（其中18 例CTCs 阳性），认为肝移植术前血中CTCs 阳性者，移植后易发生早期肿瘤复发，CTCs 可以作为判断肝移植后肿瘤复发时间的独立指标。Wang等[13]报告，CTCs 定期检测可评估肝移植后疗效和肿瘤复发。

1.3CTCs 与治疗及预后的关系

1.3.1肝癌术后疗效的判断 Huang 等[14]将肝癌术后患者共117 例分成两组，肝动脉化疗栓塞（TACE）组和对照组，TACE 组在术后1 个月再行TACE 治疗，并分别于TACE 术前1 天、术后定期多次检测患者CTCs，对照组术后未行TACE，结果显示，TACE 组的CTCs 平均计数和肝癌复发率均明显优于对照组（P＜0.05），从而认为肝癌术后行TACE 治疗是有效的，CTCs 可作为疗效判断的依据和评估预后与复发的指标。有研究已经证实，检测治疗前后CTCs 数量上的变化，可以了解肝癌细胞对治疗的敏感性和增殖活性[5]。

1.3.2预后的判断 CTCs 数量增加往往提示对治疗不敏感，预后差。刘子鑫等[15]研究也证实了这一结果。沈敏娜等[16]对481 例恶性肿瘤患者的循环肿瘤细胞进行回顾性分析发现，肝癌患者阳性检出率为53%，并对CTCs 进行CK 染色后观察其治疗前后形态，体积和细胞核的变化：（1）治疗后体积有变化者治疗反应及预后好；（2）体积稳定组治疗反应不佳；（3）CK 染色增强组预后不良；（4）CTCs 凋亡组预后良好。王喜术等[17]对111 例原发性与56 例复发性肝癌患者各表型CTCs 阳性率比较，显示肝癌不同表型的阳性率与其临床病理特征具有显著相关性。王春梅等[18]用吉替奥治疗原发性肝癌根治术后循环肿瘤细胞阳性患者，将56 例患者分为治疗组和对照组，观察治疗后CTCs 数目、毒副作用和无瘤生存时间，结果显示：治疗组1 个月后明显下降，无瘤生存期延长，未增加毒副作用。曾健滢等[19]研究表明，AFP 水平与检出个数呈正相关，提示CTCs 检测有较好的临床应用价值。

2 循环游离核酸

Mandel 和Metais[20]首次提出了细胞外游离核酸的概念。他们发现在人体血液循环中，存在游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，进一步研究证实，其主要来源于循环中细胞的裂解或凋亡坏死细胞的主动释放，包括循环游离DNA、游离微小RNA、长链非编码RNA、环状RNA 等，也可以由于机体免疫系统破坏或者手术刺激等导致肿瘤细胞坏死破裂，形成的核酸被动释放。多项研究显示，HCC 循环游离DNA 水平越高，则疾病严重程度越高[11]。循环肿瘤DNA（ctDNA）通常是指肿瘤细胞凋亡后进入外周血循环的游离核酸，一般由70～200 个碱基对组成，目前在液体活检中研究较多。通过对肝癌患者血液中的ctDNA 研究，可以随时了解患者手术治疗前后的变化，评估药物治疗后的疗效以及对预后的判断。Xu 等[21]报告ctDNA 甲基化标志物可用于肝癌的诊断、病情监测。他们将大样本的肝癌患者ctDNA 甲基化应用于肝癌诊断，并设置正常对照组的相关性研究，结果显示，ctDNA 有较好的临床应用前景。Mansour 等[22]通过对肝癌患者ctDNA 携带的Ras 相关区域家族1A（RASSF1A）甲基化水平的研究，支持了这一结论。Yan 等[23]研究表明，循环游离DNA 联合AFP 检测提高了对肝癌的诊断准确率。

有研究证明，外周血中ctDNA 数量与肿瘤负荷成正比[24]。ctDNA 的半衰期时间很短，一般在15min～2.5h，因此，短暂的半衰期意味着我们检测ctDNA 得到的肿瘤信息也是短暂的。目前，ctDNA 的检测方式主要有两大类，一类是基于PCR 技术，其敏感性较高，但只能检测已知的突变位点。另一类是基于二代测序（NGS）技术，可检测未知突变，但检测过程复杂，成本高，耗时长。

3 外泌体

外泌体是存在于细胞外的微小脂质囊泡，直径为50～140nm，形似茶托，可由各型细胞的胞吐作用释放到细胞外微环境，携带有多种生物学信息的外泌体通过与特定“靶细胞”表面受体相结合，将信息传递给其他细胞，从而影响肿瘤代谢甚至转归[3]。目前认为，不同细胞来源的外泌体具有不同的成分与功能，并受到细胞微环境的动态影响；对人体的生理与病理过程有重要作用，可作为疾病诊断的生物标志物。

多项研究表明，外泌体参与肝癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种癌症的发生发展，其作用机制可能为：（1）介导肝癌细胞间通讯；（2）介导肿瘤细胞和非肿瘤细胞间通讯；（3）调节肝癌组织微血管生成[25]。作用的途径：通过改变组织的微环境，直接融合、与表面蛋白结合和胞吞作用三种方式作用于靶细胞[19]。

齐寒等[26]在肝癌转移瘤小鼠模型上，系统评估不同来源的外泌体对肝癌生长、转移及免疫微环境的影响，结果提示Hepa1-6 细胞来源的外泌体对肝癌生长和肺转移具有一定的抑制作用，但对肝癌免疫微环境无明显调控作用；而肝癌原位移植瘤小鼠血清来源的外泌体能促进肝癌生长、肺转移。黄修燕等[27]通过将高转移潜能肝癌细胞外泌体与低转移潜能肝癌共培养，促进了低转移潜能肝癌侵袭能力，认为与外泌体circRNA-100338 水平提高及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性增强有关。外泌体携带的信息多种多样，可能通过不同种类miRNAs 的异常表达间接调控肝癌细胞[27]，周围组织细胞借助其分泌的外泌体相互作用，促进或者抑制肿瘤的生长。例如，肝癌患者血清外泌体miR-665 水平明显升高。其水平与肿瘤直径、局部浸润、临床分期和生存时间均密切相关，由于外泌体具有反映疾病状态的能力和细胞通讯作用，其可作为肝癌的诊断、复发及预后生物标志物，并且有望用于肝癌的治疗[28]。

液体活检有多种方法，目前最新采用的高通量测序、PCR 等手段，对检出极微量的肿瘤来源核酸等标志物具有很高的敏感性，因此可以用于肿瘤的早期乃至超早期筛查。在汤钊猷院士和樊嘉院士的指导下，上海中山医院肝肿瘤外科周俭教授团队[29-30]率先开展了“建立miRNA 肝癌早期诊断新技术”，构建的miRNA 早期诊断模型，灵敏度较AFP 提高30%，并转化研制出国际首个miRNA 肝癌检测试剂盒，多中心临床试验证实提高了早期和极早期肝癌的检出率。他们在CTCs 的研究中证实，外周血EpCAM+CTCs 是肝癌复发转移的“种子”，可作为肝癌复发转移的独立预测指标，研制出国际首台CTC 分选检测系统，实现了同类进口设备的替代和升级[16]。

4 问题及展望

“液体活检”或称“血液活检”，与活体组织检查比较有很大的优势[31]。外周血标本是临床上理想的标本来源，无创易采，目前，液体活检研究的CTCs、ctDNA 及外泌体等，在基础和临床研究中取得了一系列进展，但还存在下列问题[10，32]。

4.1肝癌表型与临床特征的关系 肝癌细胞有不同的表型，各表型之间及其与临床特征的关系还未完全弄清，需要进一步探索，目前应用PCR 和NGS 技术，可在单细胞水平了解基因的信息变化，将有助于此研究[33]。

4.2液体活检技术的完善 上述的几种液体活检方法，由于多种原因，还未能广泛应用于临床，下一步需要：（1）更加高效、敏感、价廉的富集检测和纯化，冷储设备；（2）规范统一标准和操作流程，使各科研结果利于比较和可重复性；（3）开展多中心、大样本的临床研究，并有望在分子生物学水平进一步阐述肿瘤发展机制，从而为肝癌患者临床分期、预后判断及个体化诊治带来新的希望。

4.3肝癌细胞异质性的挑战 当前，肝癌的诊断与治疗面临最大的挑战是肝癌的高度异质性，表现为在同一时空，不同肿瘤部位的癌细胞可能有不同的癌基因表达，以及在不同时空，肿瘤基因组的不稳定性；另外，缺乏特异的诊断标志物，很难对肝癌进行分子病理水平的精准诊断和治疗。而液体活检恰恰可以克服上述诊治上的难点，给未来的发展提供更大的空间和机遇。

4.4展望 通过对肿瘤细胞生物学、基因组学、代谢组学、蛋白质组学和高通量技术进一步研究，找出肝癌细胞异质性，分析细胞亚群之间的关系，将液体活检技术引入到原发性肝癌的筛查、诊断和临床分期及疗效和预后评价，在肝癌的精准医疗中发挥独特作用。