梅毒螺旋体耐抗生素研究进展

裴晓燕 田洪青

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院，山东省皮肤病性病防治研究所)，济南，250022

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponemapallidum，Tp)感染所引起的传染性疾病，主要通过性接触和母婴传播。根据国家疾控中心的统计，1991年全国报告梅毒1892例，当年发病率0.16/105，此后每年报告的病例数逐渐增多，发病率也大幅度增高。到2019年全国报告(http.//www.nhc.gov.cn)梅毒病例数已达535819例，发病率38.37/105，死亡人数42例，死亡率0.003/105。在我国甲乙类传染病报告中常年位居前三。据WHO统计，世界每年仍有1200万梅毒新发病例，且90%以上发生在发展中国家[1]。梅毒也会增加HIV的传播和感染机率[2]。梅毒疫情已成为全球普遍关注的公共卫生问题。由于梅毒疫苗尚未研发成功，控制梅毒疫情主要措施是早期诊断梅毒感染并给予抗生素治疗。尽管Tp对青霉素依然敏感，但临床Tp菌株对常用替代药物大环内酯类抗生素的耐药已经非常普遍[3]。

1 梅毒治疗及耐药现状

青霉素自20世纪40年代首次应用以来，一直是治疗梅毒的首选药物。有研究显示，在性传播感染(STI)临床评估的患者中，约有15%报道为青霉素过敏。针对无法使用青霉素的患者，可将多西环素、头孢曲松、阿奇霉素作为非妊娠梅毒患者的替代治疗药物[4]。对青霉素耐药，需要那些缺乏水平基因转移机制的细菌(如Tp)进行多步突变才可能完成，因此现在普遍认为Tp不太可能对青霉素产生耐药性[5]，而且目前尚未有关于梅毒对青霉素耐药的情况被报道。头孢曲松对早期梅毒有较好的治疗作用,但必须注意到头孢曲松同样也存在过敏的问题,并与青霉素间存在约5%～10%的交叉过敏,在对此类患者的治疗上应当慎重[6]。多西环素由于其疗效好、给药方便等特点在梅毒治疗中广泛应用，这对不能使用青霉素治疗的非妊娠患者来说是一个合理的选择。口服阿莫西林可以有效治疗早期梅毒，有报道称大剂量口服阿莫西林(3000 mg/d)联合丙磺舒可有效治疗非妊娠期HIV感染患者的梅毒[7]。以阿奇霉素、红霉素为代表的大环内酯类抗生素具有疗效好、成本低、患者依从性好等特点，还广泛用于治疗其他感染性疾病。但由于携带大环内酯类耐药突变(A2058G、A2059G)的Tp菌株在世界各地区广泛存在，目前已不再推荐阿奇霉素治疗梅毒。

1.1 梅毒螺旋体大环内酯类耐药情况 以阿奇霉素、红霉素为代表的大环内酯类抗生素可与核糖体50S亚基23SrRNA可逆性结合，从而抑制蛋白质合成。具有疗效好、成本低、患者依从性好等特点，除此之外还可用于治疗其他如生殖道衣原体、淋病等性传播疾病。在90年代中期，阿奇霉素一度成为梅毒防治的重要药物，且其临床疗效在美国、非洲、中国等地进行的临床对照试验中也得到了证实[2]。2002-2003年，美国发现了阿奇霉素治疗梅毒失败的病例[8]。2004年Lukehart等[9]从阿奇霉素治疗梅毒失败的患者身上分离出Tp样本，经测序比对后发现23SrRNA基因的2058位由腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G(A2058G)。2009年，Matejkova等[10]确定了第二个大环内酯类耐药突变位点在核糖体23SrRNA基因的第2059位由腺嘌呤A突变为鸟嘌呤G(A2059G)。通过梅毒兔模型，研究人员发现A2058G在没有抗生素压力及亚治疗浓度下可稳定存在。A2058G对14环(红霉素、克拉霉素)、15环(阿奇霉素)药物有抗性，但对16环(螺旋霉素、泰洛星)无抗性，这可能是由于药物与SS14株的差异结合所致。有研究表明，大环内酯类耐药菌株更容易出现在使用过大环内酯类抗生素治疗疾病的人身上，这说明低浓度大环内酯类药物的持续存在可能选择出对大环内酯类耐药Tp菌株，并激发新的突变。大环内酯类耐药性的产生与其药物消耗量有关[11]。阿奇霉素在上世纪90年代初进入全球市场，广泛用于治疗呼吸道感染和其他性传播疾病。在广泛使用联合抗逆转录病毒疗法之前，阿奇霉素也曾大量用于HIV感染者的治疗。阿奇霉素半衰期为68 h，可在耐药选择浓度下持续15～30天。相比其他作用时间短的大环内酯类药物，阿奇霉素更有可能筛选出耐药菌株。A2058G、A2059G突变在Tp菌株同时出现的情况尚未被报道。Chen等[12]开发了一种多重RT-PCR检测方法，可以快速检测Tp的A2058G和A2059G突变。利用该检测方法及时鉴定大环内酯耐药Tp菌株，有助于临床医生针对青霉素过敏且感染梅毒的患者选择合适的治疗方法。近年来，携带大环内酯类抗生素抗性突变的梅毒螺旋体菌株在美国、中国、澳大利亚等地已十分常见。例如，旧金山梅毒患者标本中带有A2058G突变的Tp从4%(2002年)增加到76.5%(2005年)，西雅图梅毒患者标本中从9%(2002年)增加到56%(2005年)[4]。在近几年的报道中，法国A2058G突变的Tp已超过85%，意大利、古巴和巴塞罗那等国家和地区的大环内酯类耐药的Tp均超过90%。除非是在梅毒螺旋体对大环内酯类耐药率极低的地区或者无其他替代疗法的情况下，目前已不再推荐阿奇霉素治疗梅毒[13]。

1.2 克林霉素耐药 克林霉素是林可霉素的一种半合成衍生物，抗菌谱与林可霉素相同。临床上常用于治疗革兰阳性菌和厌氧菌引起的各种感染，抗菌作用机制与大环内酯类相同，通过与核糖体50S亚基23SrRNA可逆性结合，从而抑制细菌蛋白质合成。在早期进行的梅毒兔模型试验中发现，单次肌注克林霉素对Tp数量几乎没有影响，多次肌注可使Tp数量减少至原来的1/7～1/5，效果明显低于相同剂量的红霉素和青霉素，因此认为Tp对克林霉素有一定的固有耐药。克林霉素耐药的机制包括核糖体50S亚基抗生素结合位点(23SrRNA)发生酶甲基化、靶点突变以及抗生素分子主动外排等[14]。在某些肠道螺旋体、幽门螺旋杆菌中，23SrRNA的A2058G突变是造成其对克林霉素高抗性的主要原因之一。Tp对克林霉素的高耐药性有可能是其固有耐药性加A2058G突变的结果。

1.3 利福平耐药 利福平通过与由rpoB基因编码的RNA聚合酶rpoB的β亚基结合来抑制细菌RNA合成。1997年，Alekshun等证实伯氏疏螺旋体对利福平耐药，是由于在与大肠埃希菌的S531蛋白同源的rpoB残基上1个天冬酰胺(N)替代了丝氨酸(S)所致(即N531)，这种情况可能也存在于其他螺旋体中。在对Nichols株和钩端螺旋体(Leptospira biflexa)的rpoB进行了完整的氨基酸序列分析后，证实了N531的存在。细菌靶点氨基酸序列改变(N531)，导致了rpoB对利福平的亲和力降低，因此这一突变被认为是螺旋体对利福平天然耐药的主要原因[15]。关于利福平耐药的常见机制还包括rpoB外部的两个高度保守的区域(如Rif簇I和Rif簇II)的突变，可降低抗生素的膜渗透性、促进外排以及靶点酶修饰等。但在目前发现的这些突变中，只有N531与Tp有关。

2 梅毒螺旋体四环素类耐药研究进展

2.1 四环素耐药分子机制 四环素耐药基因(Tetracycline resistance genes)简称tet基因。目前已有40余种tet基因被报道。 大多数tet基因可接合在质粒、转座子、整合子等可移动遗传元件上，这些遗传元件菌群大量传递使细菌获得四环素耐药基因，从而对四环素产生了耐药性，即获得性耐药。不同的tet基因可编码不同的蛋白质，介导不同的耐药机制。目前研究较多的是泵出机制、核糖体保护机制、酶失活机制。

除了耐药基因，细菌核糖体的突变也可造成自身对四环素耐药。1998年，Ross等在对耐四环素丙酸杆菌进行基因测序之后，发现其16SrRNA基因的第1058位由胞嘧啶取代了鸟嘌呤(G1058C)，发生点突变的区域被称为螺旋34(h34)，该区域对肽链的终止和翻译的准确性非常重要。之后，又在其他菌群中陆续发现四环素耐药相关的16SrRNA点突变，如A965T、A967T/C、AGA965-967TTC和U1199C等。

2.2 四环素类药物治疗梅毒现状 四环素类药物是一类广谱抗生素。除抑制细菌外，对立克次体、支原体、衣原体和原生动物寄生虫也有较强的抑制作用。曾长期作为临床抗感染治疗的主要抗生素。

相较于四环素，多西环素具有疗效好、给药方便、不良反应小等特点，目前已不再推荐使用四环素[16]。多西环素可有效预防多种螺旋体感染疾病如莱姆病(Lyme disease)、钩体病、梅毒等[17]。自多西环素应用于梅毒的治疗以来，人们对其疗效进行了监测和长期回顾性的探索。早期进行的多西环素和苄星青霉素治疗梅毒的疗效对比实验，结果显示多西环素组的治疗成功率均为100%。但近年来多地区均发现多西环素治疗梅毒失败的情况。2014年，北京[18]和台湾[19]两地的学者再次对多西环素和青霉素进行了药效对比试验，这次的试验结果显示多西环素的治疗成功率已不如之前，分别为82.9%和65.9%。Stamm等[2]推测，多西环素治疗梅毒失败有可能是四环素梅毒螺旋体耐药菌株的出现所致。在以梅毒合并HIV感染的患者为研究对象所进行的药效对比试验中，多西环素与青霉素的治疗效果无显著差异，两者的血清治愈率分别为85%和83%[20]。美国CDC建议口服多西环素作为早期梅毒的替代治疗，而英国指南建议将多西环素作为神经梅毒的替代治疗[17]。

2.3 梅毒螺旋体四环素耐药情况 在20世纪50年代中期以前，大多数共生菌和致病菌都对四环素敏感。1953年第一个耐四环素的志贺痢疾杆菌被检测出来。随后的几十年内，耐四环素的各种菌株不断增多，而且以多重耐药为主。

tetB 基因是分布最广的四环素耐药基因，主要参与泵出机制。1996年，Roberts等对16株齿垢密螺旋体菌株进行了Southern blot杂交和PCR检测，结果发现有7株携带 tetB基因，5株同时携带tetB和ermF基因(编码红霉素抗性的rRNA甲基化酶)，由此将tetB基因的宿主范围扩展到了密螺旋体属。之后Xiao等[21]对山东省2014-2015年171例早期梅毒Tp样本进行测序，发现有17株携带tetB基因，未发现16SrRNA基因发生点突变。此前梅毒螺旋体获得性四环素耐药基因tetB基因未见报道。

2017年，Giacani等[22]对从意大利四个地区的60例患者身上搜集到的Tp样本进行了大环内酯类和四环素类耐药突变位点的检测，发现94.3%(50/53)的菌株对大环内酯类耐药，未发现与四环素类相关的突变；之后Grillov等[23]对古巴2012-2017年搜集到的83例患者的Tp样本进行了相同的测序比对，其中90%的患者都感染了发生A2058G突变的菌株，但未发现四环素耐药突变位点。 2019年Fernndez等[24]对巴塞罗那地区Tp样本23SrRNA、16SrRNA进行了测序比对，结果显示大环内酯类耐药突变占95%，四环素耐药突变占0%。

目前为止进行的梅毒螺旋体全基因组测序中，尚未检测到tet基因，但大环内酯类耐药情况则十分普遍[25]。在近期的一项研究中，对4株Tp SS14菌株进行了体外药敏试验，结果显示多西环素对体外环境中的Tp有明显的抑制作用，这说明多西环素对梅毒的治疗仍然非常有效[26]。

3 结论

综上所述，我们可以发现青霉素依然是治疗梅毒的主力军。许多地区的梅毒螺旋体菌株对大环内酯类的耐药已非常普遍，但尚未对四环素类抗生素产生大规模耐药。大环内酯类耐药菌株的出现可能与大环内酯类抗生素在临床上的广泛应用有关[27]。因为它们的治疗作用不仅是针对梅毒，也可能是用于沙眼衣原体、淋球菌感染和非淋球菌感染性尿道炎等疾病。同样的思路可应用于预防四环素耐药菌株出现，故临床上使用四环素或多西环素治疗时，应持续对其进行疗效监测，并警惕耐药菌株的出现。考虑到抗生素在许多感染性疾病的治疗上已经出现了广泛耐药，为了避免这种情况发生在梅毒治疗中以及限制抗生素的使用，人们迫切地希望能够研发梅毒疫苗。