胆道闭锁的遗传学研究进展*

潘东明，刘磊

（深圳市第三人民医院/南方科技大学第二附属医院1.儿科；2.医院办公室，广东 深圳 518112）

胆道闭锁（biliary atresia,BA）是新生儿期发生的严重肝胆系统疾病，以肝内和肝外胆管的进行性炎症和纤维性梗阻为特征，是目前儿童肝脏移植的重要原因之一。胆道闭锁发病率具有种族和地区差异，亚洲发病率高于欧美，中国大陆相关BA 发病率数据统计不全面，中国台湾地区为1.78/10000［1］。根据2018 版胆道闭锁诊断及治疗指南［2］，肝门空肠吻合术（Kasai 手术）应当作为胆道闭锁的首选治疗方案，Kasai 手术后出现肝衰竭或者肝功能失代偿需要进行肝移植手术治疗。

胆道闭锁目前病因尚不明确，遗传因素、病毒感染、环境因素等都在其中发挥作用。本文将从遗传角度系统梳理胆道闭锁的病因学最新研究进展，包括表观、基因多态性、单基因突变三个方面。

1 DNA 甲基化与胆道闭锁

DNA 甲基化是表观遗传的主要形式之一，其主要参与基因表达调控、重金属修饰、蛋白质功能调节以及核糖核酸加工，基因组DNA 甲基化状态改变会引起基因表达异常或染色体结构的不稳定［3］。大量研究证实DNA 甲基化与多种疾病如癌症、印记基因疾病、自身免疫疾病、代谢疾病、神经系统疾病的发生发展有关［4-5］。

现有研究发现多个基因的甲基化与胆道闭锁存在关联，如Foxp3、Alu 与长散在重复序列-1（LINE-1）、ITGAL、γ-干扰素（IFN-γ）、ATX。

Foxp3 是控制Treg 细胞发育和功能的关键转录因子，其在多种肝脏疾病中存在异常表达修饰，进而调节Treg 细胞的功能影响疾病的发生发展［6-7］。LI 等［8］研究发现，相比正常对照，胆道闭锁患者与小鼠模型中Treg 细胞的Foxp3 启动子区CpG 岛存在显著高甲基化。在恒河猴轮状病毒感染的胆道闭锁小鼠模型中，通过注射甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-Aza）可以一定程度缓解胆道闭锁症状。并且注射5-氮杂胞苷小鼠相比未注射的感染模型，其Treg 细胞具有更好的抑制功能。因此推测Treg 细胞中Foxp3 启动子区异常的甲基化状态将损伤Treg 细胞抑制功能，进一步加重胆道闭锁的炎症损伤程度。

Alu 和LINE-1 元件是逆转录转座子，在人类基因组中普遍存在，会导致基因组不稳定，特别是与端粒长度有关。UDOMSINPRASERT 等［9］研究发现，胆道闭锁患者相比健康对照，其外周血Alu 与LINE-1 显著低甲基化。LINE-1 甲基化与患者肝纤维化程度相关，并且胆道闭锁患者中Alu和LINE-1 的甲基化与端粒长度呈正相关，低甲基化的患者端粒长度更短，其转录活性升高的同时增加机体氧化应激对DNA 的损伤。

CD4+T 细胞的ITGAL 启动子调控元件低甲基化引起表达升高在很多自身免疫疾病患者中广泛出现［10］。DONG 等［11］通过测量胆道闭锁患者与健康对照的CD4+T 细胞ITGAL 的基因表达与甲基化状态发现，ITGAL 在胆道闭锁患者CD4+T 细胞中显著下调，这与其启动子区高甲基化相关。通过DNA 甲基化抑制剂治疗后，ITGAL 启动子甲基化下调，其基因表达上调。

IFN-γ 是机体发挥固有免疫应答和适应性免疫应答反应中重要的细胞因子，IFN-γ 异常表达会导致一些自身炎症和免疫性疾病的发生。DONG等［12］研究发现胆道闭锁患者CD4+T 细胞IFN-γ 表达相比健康对照显著增高，IFN-γ 基因启动子区域存在显著低甲基化。YANG 等［13］进一步研究胆道闭锁患者中miR-29b/142-5p 对IFN-γ 基因甲基化的调控作用。研究发现，患者中miR-142-5p、DNMT1 高表达，miR-29b 与DNMT3a/DNMT3b 的表达在胆道闭锁的肝脏中呈现负相关，并且LINE-1、Alu、SAT2 和IFN-γ 启动子区域存在低甲基化，IFN-γ 的表达上调。最终，研究推断miRNA-29b/142-5p 的高表达可以抑制DNMTs 表达，导致甲基化降低，进而IFN-γ 基因过表达。

UDOMSINPRASERT 等［14］通过对65 个胆道闭锁患者与65 个正常对照的外周血ATX 基因进行甲基化检测与表达量检测，结果发现，胆道闭锁患者ATX 基因的启动子区特定的CpG 岛存在低甲基化，并且胆道闭锁晚期相比早期患者甲基化程度更低。并且，启动子低甲基化、ATX 过表达与胆道闭锁患者的黄疸状态、肝功能障碍以及肝脏僵硬程度相关联。

综上，Foxp3 启动子CpG 岛的高甲基化会损伤Treg 细胞抑制功能，加重胆道闭锁发生的炎症损伤。Alu 和LINE-1 低甲基化，可能增加机体氧化应激对DNA 的损伤，导致肝纤维化程度加重。TGAL 启动子区低甲基化，可能引起T 细胞功能异常。IFN-γ 启动子区低甲基化，可能诱导慢性炎症反应，促进胆道闭锁的发展。以上研究可以看到DNA 甲基化在胆道闭锁中发挥重要作用，特别是影响免疫细胞功能或者参与机体氧化应激造成炎性损伤。ATX 启动子区的低甲基化导致其蛋白过表达，促进肝纤维化进程。目前还没有对胆道闭锁全基因组层面的相关研究，新的组学技术的发展特别是单细胞甲基化测序技术的发展如scRRBS、scBS-seq、scWGBS 等将进一步推动领域的研究［15］。

2 基因多态性与胆道闭锁

基因的多态性可能导致肝脏的炎症以及纤维化的易感性增强，通过不同的SNP 基因分型技术可以研究特定基因的分型与胆道闭锁的关联［16］。目前已经报道与胆道闭锁相关的基因多态性基因包 括 EFEMP1［17］、ADIPOQ［18］、ITGB2［19］、VEGF［20］、USF2［21-22］、ADD3［23-28］、GPC1［29］、ARF6［30］、IFNG［31］、MIF［32］、ICAM1［33］等。

GARCIA-BARCELÓ 等［23］在包含200 中国胆道闭锁患者与481 个健康对照的队列中采用全基因组关联分析寻找胆道闭锁的风险位点，结果发现包含XPNPEP1 与ADD3 的区域的多个突变与胆道闭锁风险较高。CHENG 等［24］扩展了先前的研究，在包含339 个胆道闭锁患者与401 个健康对照的队列对10q24.2 的107 个SNP 位点进行检测，发现rs17095355 位点最显著相关，10q24.2 区域的SNP 位点通过调节肝中ADD3 的表达，可能在一定程度引起胆道闭锁。在先前的研究中［27］，汉族人群队列（134 胆道闭锁患者与618 个健康对照）中对ADD3 的两个风险位点也进行了验证。结果发现SNP rs17095355 在共显性模型中与胆道闭锁相关，rs10509906 在加性模型下与胆道闭锁相关。并且T(a)-G(b)（a 为rs17095355,b 为rs10509906）基因型相比C(a)-C(b)基因型风险显著升高。WANG 等［25］选择了ADD3 的三个SNP 风险位点在510 个胆道闭锁患者与1 473 个健康对照的队列中进行验证。分析结果显示，rs17095355 与rs2501577 两个位点在该队列证实与胆道闭锁相关联。LAOCHAREONSUK 等［26］在泰国婴儿队列（56 个胆道闭锁患者与166 个健康对照）中对ADD3 的三个位点（rs2501577,rs11194981,rs12268910）进行验证。分析结果支持三个位点在胆道闭锁患者中显著高于对照，并且rs17095355与rs2501577 累加具有更高风险。

CHEN 等［17］对欧美队列343 个散发胆道闭锁患者与1716 个健康对照进行GWAS 分析，Meta分析发现三个与胆道闭锁高度相关的SNP 位点，位于2p16.1（rs10865291,rs6761893,and rs 727878；P<5×10-8），这些SNP 位于EFEMP1 基因的5 号内含子。基因表达检测发现胆道闭锁患者的EFEMP1 表达量更高，免疫组化结果显示，EFEMP1 在胆道闭锁患者的肝脏标本中的胆管细胞和血管平滑肌细胞中表达，但在正常对照肝脏样本中的胆管细胞中则没有表达。因此，EFEMP1 是胆道闭锁的潜在风险基因。

HUANG 等［21］在包含52 个胆道闭锁患者与96个健康对照的队列研究USF2 rs916145 与疾病的关联，结果发现rs916145 的C 等位基因在胆道闭锁患者中频率更高。但是该结论在更大队列并未得到证实。CHEN 等［22］在中国南方人群队列中研究USF2 rs916145 与胆道闭锁的关联，该队列包含506 个胆道闭锁患者与1 473 个健康对照。结果发现不同基因型不存在显著统计学差异，USF2 rs916145 多态性与胆道闭锁不存在关联。

通过以上研究可以看到，采用全基因组关联分析结合现有数据库，可以为诸如胆道闭锁之类疾病的风险位点研究提供全局线索。而针对同一SNP 位点，不同遗传背景、甚至样本数量都可能影响对风险位点的评估。因此，要阐明胆道闭锁的病因，全基因组关联研究以及相关的数据共享将尤为重要。

3 单基因突变与胆道闭锁

胆道闭锁患儿出生时约20%存在肝胆系统形态学发育异常，并且常伴有多发畸形，提示胆道闭锁可能与染色体异常、胆管发育调控相关基因有关。GIRARD 等［28］对目前在胆道闭锁患者中报道的染色体异常、基因突变与相关综合征进行了总结。对于染色体异常，多数报道为染色体重复如18 三体、猫眼综合征相关的22 三体或者四体。CHENG 等［34］对包含89 个三期非综合征胆道闭锁患者队列开展全基因组拷贝数突变分析。结果发现29 个胆道闭锁相关的拷贝数变异，这些拷贝数变异区域包含的基因富集在炎症相关通路，提示免疫-炎症在胆道闭锁中的重要作用。但是目前没有发现与胆道闭锁明确相关的单一致病染色体异常。

对于单基因疾病，目前案例报道较多［28］，部分基因与肝脏疾病相关，如JAG1［35］、PKHD1［36］等。JAG1 是Alagille 综合征的致病基因，该疾病为常染色体显性遗传，并且存在外显不全。PKHD1 为常染色体隐性多囊性肾病的致病基因，该疾病与肝囊肿以及纤维化相关。SANGKHATHAT 等［35］对20 个胆道闭锁患者进行全外显子测序，重点分析19 个婴儿胆汁淤积症相关基因，结果发现8 个基因存在杂合突变（MYO5B、ABCC2、ABCB11、UGT1A1、MLL2、ERCC4、KCNH1、JAG1），但是这些患者并不存在相关疾病症状，提示这些突变可能是偶发，并不一定与胆道闭锁相关联。与此同时，部分案例报道了胆道闭锁中与肝脏无关的基因的突变，如CFC1、ZIC3，这些基因与胆道闭锁的关联需要更多研究［28］。

在以上不同的案例报道和研究中，部分基因突变导致疾病与胆道闭锁存在一定关联，但是其作用更像是一种累加因素，并不是胆道闭锁的决定原因。部分结果由于是基于散发案例的报道，其更可能是偶发因素，基于现有结果无法判断其与胆道闭锁的关联。随着全外显子/全基因组测序在临床诊断中的应用普及，利用其在拷贝数变异、结构变异分析中的分析优势，相信未来对于胆道闭锁的致病基因将会不断加深，发掘出更多的相关基因。

除了以上表观与基因组层面，microRNA 与胆道闭锁的关联也存在大量研究。研究发现，miR-200a/b、miR-21、miR-29、miR-222 在胆道闭锁肝纤维化中发挥重要作用，且多项研究证实，microRNA 可协同多个基因，形成复杂的纤维化网络途径［37］。

随着测序技术的发展与应用，基于临床队列的研究不断发掘新的胆道闭锁相关基因，这些基因从免疫反应、炎症、遗传易感性、纤维化等诸多方面，揭示胆道闭锁的致病机制，这些研究将可能为胆道闭锁的诊断、治疗提供更多新的视角，与此同时为胆道闭锁的临床精准治疗提供新的可能靶点。