呼吸道深部真菌感染检测方法分析

郭治伟

绝大多数机会性真菌病通常是由组成正常人类微生物群的病原体(如念珠菌和曲霉)引起的,因其在自然界的普遍性使其很容易获得免疫受损宿主［1,2］。老年人通常长期使用广谱抗菌药物或激素,这可能巧合导致宿主体内微生物菌群失调,也可能直接干扰宿主的免疫状态,严重减弱宿主免疫系统的效力。此外人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、肿瘤化疗或干细胞移植等因素都能导致条件性真菌感染增高。当宿主的免疫反应受损惨重时,体内这些生物体会从无害的共生体转变成侵入性病原体［3］,而且这些机会性真菌通常会引起严重的感染。为了及时准确找到侵入的病原体,帮助临床医生明确患者诊断,指导临床合理选药和用药,必须要选用恰当的检测方法,提高真菌的检出率。本研究对呼吸道深部真菌感染4 种检测方法的检测结果进行对比分析,探索最佳的检测方法和方案。

1 材料与方法

1.1 材料 选取本院呼吸科2019 年1 月～2020 年4 月收治的317 份疑为深部真菌感染患者的下呼吸道标本,其中痰(清洁口腔后,自然深咳痰)96 份,气管吸取物147 份和肺泡灌洗液74 份。痰和气管吸取物的选取标准：白细胞＞25/低倍镜视野,上皮细胞＜10/低倍镜视野；白细胞＞25/低倍镜视野,上皮细胞10～25/低倍镜视野或白细胞10～25/低倍镜视野,上皮细胞＜10/低倍镜视野；排除不合格的送检标本。

1.2 试剂与仪器 OLYMPUS 显微镜(带有荧光模块,波长：340～380 nm)、革兰染色液(温州市康泰生物科技有限公司)、Baso 真菌荧光染色液(珠海贝索生物技术有限公司)、沙保罗琼脂培养基(温州市康泰生物科技有限公司)、两个恒温培养箱、10%氢氧化钾(KOH)溶液。

1.3 方法 将每份标本随机分为4 份,分别用于真菌培养法、10%KOH 湿片法、革兰染色法和荧光染色法检测。

1.3.1 真菌培养 用无菌拭子沾取适量的下呼吸道标本(肺泡灌洗液离心后,用移液枪吸取适量沉淀标本),用平板划线法把每份标本同时接种至2 个沙保罗琼脂培养基上,然后分别放置在28℃和35℃的恒温培养箱培养2 周,每天观察生长情况,若有菌落形成,通过菌落特征及显微镜下特征确认后则可以判定为阳性。如果没有菌落生长则持续观察,最长培养至2 周,若仍无菌落生长,则判定为阴性。

1.3.2 10%KOH 湿片法 取适量标本置于载玻片上,滴加1 滴10%KOH 溶液,覆盖上盖玻片,并在酒精灯火焰上快速通过2～3 次(保证不要沸腾),轻压盖玻片,用无菌棉签吸去边缘溢出的多余液体,先用低倍镜找到样本所在位置,再用高倍镜观察菌丝或孢子等结构。若高倍镜下观察到真菌菌丝或孢子则判定为阳性。如果高倍镜下未找到真菌菌丝或孢子则判定为阴性。

1.3.3 革兰染色 先取适量的标本涂片(肺泡灌洗液离心后,再取适量沉淀标本涂片),然后经过自然晾干和固定,再进行革兰染色,若油镜下观察到紫色的菌丝或孢子则判定为阳性。如果未发现紫色的菌丝或孢子则判定为阴性。

1.3.4 荧光染色 取适量标本涂抹(肺泡灌洗液离心后,再取适量沉淀标本涂抹)载玻片上,然后在标本上滴加1 滴荧光染色液并盖上盖玻片,轻压盖玻片,用棉签吸去边缘溢出的多余染色液后,先用低倍镜找到样本所在位置,再用高倍镜观察发出明亮荧光的菌丝或孢子等结构。若高倍镜下观察到亮蓝色真菌菌丝或孢子则判定为阳性。如果未找到亮蓝色真菌菌丝或孢子则判定为阴性。

1.4 观察指标 对比真菌培养法、10%KOH 湿片法、革兰染色法和荧光染色法的检测结果,分别比较其检测的阳性率。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

下呼吸道317 份标本检测的阳性率显示,荧光染色法检测阳性率为89.3%(283 例阳性),革兰染色法检测阳性率为76.0%(241 例阳性),真菌培养法检测阳性率为73.8%(234 例阳性),10%KOH 湿片法检测阳性率为63.4%(201 例阳性)。荧光染色法检测阳性率高于革兰染色法、真菌培养法、10%KOH 湿片法,差异有统计学意义(P＜0.05)。革兰染色法检测阳性率与真菌培养法比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。革兰染色法、真菌培养法检测阳性率均高于10%KOH 湿片法,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同标本类型4 种检测方法的检测结果比较［n(%)］

3 讨论

真菌感染可用多种方法进行诊断,通过培养检测法最为准确［4］。虽然培养检测法耗时长,限制了真菌感染的早期诊断和治疗,而且检测阳性率不如染色法高,但要获得药敏结果就必须做真菌培养。精准的选药同样依赖于菌种的正确鉴定,然而念珠菌或丝状真菌无论是用生化反应鉴定、质谱鉴定还是形态学鉴定,都需要先通过培养长出真菌菌落。可疑的真菌感染,临床送检真菌培养对诊断和治疗是非常有必要的。

通过本研究结果显示,荧光染色法检测阳性率高于革兰染色法、真菌培养法、10%KOH 湿片法,差异有统计学意义(P＜0.05)。荧光染色法检测阳性率最高,有重要的参考价值。据有关文献报道［5］,荧光染色法在患者已经用药、标本量很少等情况下依然有较高的检测阳性率。对于真菌培养阴性,而荧光染色阳性的标本,可以适当延长培养时间或重新增加接种量进行再次培养。真菌培养联合荧光染色可提高临床标本中真菌的检出率,为临床诊断及合理用药提供指导。

革兰染色检测法明显不如荧光染色检测法敏感,且革兰染色液的染料杂质容易被误判为真菌,对检测人员技术要求也较高,可以因主观因素造成误差。革兰染色的优势是染液价格便宜,操作简单,各实验室都可以常规开展。革兰染色法也可以联合培养法,提高病原体检出率,辅助真菌感染患者的临床诊断和治疗［6］。

实践证明荧光染色也可以在20 倍镜下观察,同样能找到染色后的菌丝,不仅可以避免在低倍镜下观察时漏检,也比高倍镜观察节省时间。荧光染色法只需要极短时间即可完成检验,比其他方法检测时间短。

10%KOH 湿片法可以较好的溶解组织细胞,使组织透明化,操作简单、快速且经济,但由于标本中杂质多而导致背景杂乱,对检测人员的技术水平要求比较高。本研究显示,革兰染色法、真菌培养法检测阳性率均高于10%KOH 湿片法,差异有统计学意义(P＜0.05),与相关研究结论相同［7］。据有关研究［8］表明,10%KOH 湿片法也可用于皮屑、甲屑和毛发的检验,但个人主观因素影响较大,假阳性常因为把纤维或细胞壁误当作菌丝以及把油滴或气泡误判为孢子；同时也比较容易漏检散在的孢子或菌丝,造成假阴性。

荧光染色由于染液成本较高,而且需要配套的荧光显微镜,所以至今未能广泛常规开展。真菌荧光染色剂中,经过特殊荧光素标记的重组几丁质酶可以高亲和力与真菌细胞壁上的几丁质或β-葡聚糖结合,反应灵敏且抗干扰强,在荧光显微镜高倍视野下,真菌菌丝和孢子发出明亮的荧光,清晰的图像可显著提高辨识度［9］。荧光染色不仅操作方便快捷,而且对检测人员的技术水平要求不高,可弥补技术人员经验的不足,减少操作者的主观判断带来的误差和检查结果假阴性的发生,进而可以有效降低漏检率。荧光染色可用于各类真菌的检测,包括念珠菌、曲霉菌、马尔尼菲青霉菌、组织胞浆菌、毛霉、隐球菌和肺胞子菌；这些真菌细胞壁都能与染料很好的结合而发出荧光。开展荧光染色可大大提高真菌检测的效率和准确率,在条件允许的情况下建议广泛开展。

已有文献证明［10-12］,荧光染色还可用于阴道分泌物、毛发、尿液、胸水其他体液、粪便、皮肤组织和甲屑的真菌检测,且优于革兰染色和真菌培养法。角蛋白、胶原蛋白和弹性纤维也能使用本试剂盒进行检测。希望未来会研究出比较低廉的荧光染色剂,广泛推广于实验室,提高真菌的检出率。

综上所述,荧光染色是一种快速有效的呼吸道标本的真菌检测方法,联合真菌培养可提高呼吸道标本真菌检出率,更好的辅助临床诊断和治疗。