蛋白激酶C对心脏疾病的调节机制及其抑制药的治疗作用

焦雅丽,韩 光 综述 崔 丹 审校

心脏疾病是全人类致死与致残的主要疾病之一，严重影响患者的生活质量，同时也给社会与家庭带来较重的经济负担，目前仍无有效的根治方法[1]。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可分为经典型PKC、新型PKC及非经典型PKC。PKC被激活后可参与一系列生化反应的调控，同时可参与基因表达的调控，是控制细胞分化、增殖、转换、凋亡等过程的重要调节因子[2]。PKC在心脏发育过程中发挥着信号转导的介质作用，同时与多种心脏疾病的病理生理过程相关，如心肌肥大、心律失常、心力衰竭和缺血/再灌注等[3]。因此，PKC在心脏疾病的发病机制中具有重要作用，而以PKC为治疗靶点对心脏疾病的研究具有重要的临床意义。为此，笔者就PKC在心脏疾病中的调节机制及作为治疗靶点的相关研究进展进行综述。

1 PKC对心脏疾病的调节机制

1.1 经典型PKC 经典型PKC在其N端含有两个C1结构域(C1A和C1B)，其中C1B可与二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)或磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)结合而被激活，C1结构域之后是C2结构域，其与膜相关的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)及Ca2+结合而被激活，主要包括PKCα、PKCβ和PKC亚型[4]。

在心肌组织表达的各种PKC同工酶中，PKCα是主要成员，PKCα在心脏中的功能中具有核心作用，PKCα的主要/直接作用是调节心肌收缩力，研究显示PKCα通过磷酸化抑制药1(一种蛋白磷酸酶1的负调节剂)可间接影响膜磷蛋白(phospholamban，PLN)的磷酸化及其对肌浆网钙-ATP酶(sarco plasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)的调节作用，从而调节心脏收缩[5]。PKCα在心脏中的过表达会削弱收缩性，而PKCα的缺失会导致肌浆网Ca2+负荷增加，从而增强心肌收缩性。PKCα在向心力衰竭的转变过程及心肌细胞肥大中均起着关键作用，并且是肌肉收缩性的重要调节因子。尽管PLN本身在体外也被鉴定为PKCα底物，但在健康人的心肌中，佛波酯激活PKCα后分析PLN的磷酸化水平没有增加，结果表明PKCα在体内对PLN没有直接作用[6]。心肌中肌肉LIM蛋白的主要作用在于直接抑制PKCα的表达，而当心肌中缺乏功能定的肌肉LIM蛋白后，PKCα活性的长期不受抑制会导致心力衰竭[7]。

研究显示，PKCβ和PKC对心脏的功能影响较小，因为缺乏PKCβ或PKC?基因对小鼠心脏表型的影响可以忽略[8]。然而，在心脏的病理过程中，PKCβ表达上调，结果表明该PKC同工酶在心肌病中可发挥作用。钙依赖性PKCβ主要存在于心室肌中，在人类心脏个体发育过程中，PKC-β的表达下降了90%，而在正常的成人心脏中PKCβ几乎不表达，但衰竭心脏中PKC-βⅠ和PKC-βⅡ表达数量增加了40%以上。PKC-β高度上调，导致由严重心力衰竭引起的扩张型心肌病重新表达。慢电压门控钾通道由KCNQ1和KCNE1亚基组成，是心脏主要的复极电流之一。有研究显示，PKCβⅡ是慢电压门控钾通道膜定位的特异性调节因子，在包括心脏病的状态下，PKCβⅡ的表达和激活都会显著增加，而抑制PKCβⅡ可能对心脏病相关的获得性QT延长具有保护作用，提示PKCβⅡ是一个潜在的抗心律失常的重要靶点[8]。

1.2 新型PKC 新型PKC包括PKCδ、PKCε、PKCη和PKCθ，由于缺失C2结构域，新型PKC不能与Ca2+结合，但可被DAG激活。新型PKC对心脏的影响主要表现在心脏缺血再灌注损伤中的作用，且主要影响线粒体的分子功能。然而，新型PKC同工酶也被证明能够磷酸化线粒体外的底物，包括肌球蛋白结合蛋白-C(myosin-binding protein-C，MyBPC)或电压门控钾离子通道Kv1.5[9]。研究显示，PKCθ基因敲除后的小鼠可发展为扩张型心肌病，并伴有心脏收缩分数的降低，纤维化增加，心钠素等心肌病标志物水平升高，及p38和JNK通路的激活。而PKCδ基因敲除后，心脏代谢发生了显著变化，糖酵解酶显著降低，而参与β氧化和脂质代谢的酶显著增强。出生后发育过程中这两种同工酶的丧失会导致心脏典型病理性肥大的变化[10]。此外，胚胎心脏发育过程中PKCδ and PKCε两种同工酶的缺乏对大多数双敲除胚胎具有致死性，表现为心脏异常肥大，心室腔严重受损或消失[11]。

而PKCδ和PKCε在缺血和再灌注过程中对心脏的影响却是相反的。PKCε的活化形式定位于线粒体，可磷酸化线粒体缺血预处理信号转导机制的组成部分，从而促进心肌保护[12]；而线粒体中的PKCδ被激活后可通过降低细胞内pH和ATP产生，增加线粒体ROS积累，抑制细胞保护性Akt-Bad磷酸化途径，促进细胞色素c的释放，激活caspase3和诱导凋亡，从而促进细胞色素c的释放，激活caspase3和诱导凋亡，促进细胞色素c的释放、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活和细胞凋亡的诱导，最终促进缺血再灌注损伤[13]。但关于PKCδ在心脏中的作用的研究仍存在争议，另一些研究表明，在再灌注过程中抑制PKCδ可以减轻损伤相关的病理变化，但PKCδ基因敲除不能保护心脏，反而是加重了缺血再灌注损伤，且呈现出更大的心肌梗死面积[14]。然而PKCδ和PKCε在限制心肌细胞生长和心室纤维化/重构方面起着相似的作用，研究显示PKCδ或PKCε的存在足以限制心脏对血流动力学超负荷的应激反应， PKCδ不破坏心肌内皮细胞，但PKC-ε对心肌内皮细胞可进行一定的破坏[14]。尽管PKCη在心脏中特异表达，但其在心脏中的作用还有待进一步研究。

1.3 非典型PKC 非典型PKC包括PKCζ和PKCλ/亚型，由于C1结构域的缺失及C2结构域的封闭，因此不能被DAG、PS、Ca2+激活。非典型PKC在心脏中的研究相对较少，但PKC在胚胎心脏形成中具有重要作用，研究显示PKC主要定位于胚胎心脏心肌细胞的心腔侧，可引导该心肌细胞的分裂，使心肌细胞分裂平面垂直于心脏的内腔，并驱动新生心脏的心肌小梁形成。在糖尿病小鼠模型中，心肌细胞中注入PKC后可完全逆转并恢复了通过电压依赖的L型钙通道(CaV1.2)的钙内流，表明该心脏通道是该激酶的潜在底物[15]。

PKCλ在心肌中特异性表达，研究显示PKCλ敲除的小鼠表现出葡萄糖摄取受损，并伴有全身性胰岛素抵抗、糖耐量受损或糖尿病、胰岛β细胞增生、腹部肥胖、游离脂肪酸和低密度脂蛋白-胆固醇升高、高密度脂蛋白-胆固醇降低，且PKCλ对于胰岛素刺激的AMPK介导的心肌葡萄糖摄取及胰岛素刺激的AMPK介导的脂肪酸摄取都是必需的。然而，PKCλ基因敲除的心肌细胞中残留的PKC-ζ活性可最大限度地刺激葡萄糖和脂肪酸的摄取，这表明非典型PKC在心脏底物摄取的调节中是必要的，但不是限速的，并且PKC-λ和PKC-ζ在这些过程中具有互换的功能[16]。

2 PKC抑制药对心脏疾病的治疗作用

2.1 经典型PKC抑制药 最早研究的PKC抑制药主要针对常规PKC，包括Ruboxistaurin(LY333531)，可特异性地靶向抑制PKCα/βⅡ，研究显示Ruboxistaurin可通过PKcα显著恢复猪心肌梗死模型的心肌收缩性，从而提高射血分数与心输出量，并最终逆转心脏重塑[17]。

心力衰竭是糖尿病患者发病率和病死率的常见病因，通常表现为左心室收缩功能受损。而在大鼠模型中， Ruboxistaurin可减轻糖尿病大鼠微血管缺血/再灌注损伤的风险，并可减轻舒张功能障碍、心肌细胞肥大、胶原沉积和保护心肌收缩力，原因可能与其通过抑制PKCβ，维持血管内皮屏障功能与抗凋亡作用相关，表明Ruboxistaurin可预防慢性心脏微血管屏障功能障碍，改善高糖状态下内皮细胞之间的连接功能，抑制PKC-β可能是预防糖尿病合并心功能不全的一种新方法[18]。

心肌炎是年轻人猝死、意外死亡的主要原因。研究显示，PKCα在自身免疫性心肌炎大鼠心脏中的表达水平和活性均上调，而在自身免疫性心肌炎最严重的炎性反应期末腹腔注射PKCα抑制药Ro-32-0432(口服双吲哚马来酰亚胺类抑制药)能通过降低大鼠心脏Bax/Bcl-2比值、抑制caspase-3的表达发挥凋亡作用，还能抑制心肌纤维化和促炎因子IL-1β和IL-17的释放，从而显著缓解自身免疫性心肌炎。Ro-32-0432还可通过抑制PKCα而增强心肌的收缩力[19]。另有研究表明， Ro-32-0432或Ruboxistaurin，可以提高野生型和PKCβ/γ基因敲除小鼠的收缩力和左心室形成的压力，但对PKCα基因敲除小鼠无明显影响，进一步表明上述化合物通过抑制PKCα(而不是其他PKC同工酶或相关酶)来发挥药理作用，并且PKCα是心肌收缩力的主要负调节因子。

高糖导致心肌细胞钙稳态被破坏，心肌细胞存活率降低。心脏病发作时急性高血糖也会进一步加重患者的预后，且急性高血糖症不仅限于糖尿病患者，对非糖尿病患者的应激反应也会有不良影响，而PKCα/β抑制药均可减弱高糖所致的上述不良反应。研究表明，选择性PKC抑制作用可以逆转高血糖对心脏的破坏作用，如PKCα/β被抑制，高葡萄糖本身就可以防止缺血性损伤。而PKC抑制药对正常血糖动物的血管无影响。因此，选择性的PKC抑制可能是一种有用的治疗工具，可限制因压力引起的高血糖而在心脏病发作期间造成的损害[20]。

2.2 新型PKC抑制药 虽然新型PKC家族成员在心脏中的表达没有经典型PKC那样丰富，但新型PKC抑制药也已被用于研究治疗心血管疾病和心脏移植。T细胞在实体器官移植后的移植物排斥反应中起着核心作用。因此，T细胞的免疫抑制有助于确保移植物的正常功能，并降低排斥反应的风险。因此，T细胞是预防同种异体移植排斥反应或治疗自身免疫性疾病的有吸引力的药物靶点。PKCθ在T细胞信号转导中起重要作用，是治疗T细胞介导的疾病(如移植排斥反应和自身免疫性疾病)的一个有吸引力的靶点。

新型2，4-二氨基嘧啶衍生物是一种PKCθ抑制药，具有较强的PKCθ抑制活性，对其他PKC同工酶表现出良好的选择性，研究显示可减少营养不良小鼠的炎性反应，并延长在体大鼠异位心脏移植模型中的移植物存活时间[21]。而改良的PKCθ抑制药PI，它被用来治疗链脲佐菌素诱导的1型糖尿病模型中的糖尿病性心肌病变，使用PI抑制PKCθ可显著降低T细胞的浸润，增加紧密连接蛋白ZO-1的表达，减弱该动物模型的心肌纤维化，改善心肌收缩力，并导致稍微改善心肌收缩力[22]。另外一种PKCθ的抑制药是索曲妥林，可通过选择性抑制PKCθ阻止T细胞的早期激活预防大鼠心脏移植急性排斥反应，且其治疗机制与钙调神经磷酸酶抑制药(他克莫司)不同。与单用高剂量他克莫司相比，索曲妥林联合小剂量他克莫司用药可减少心脏炎细胞浸润、降低排斥反应、延长心脏移植平均存活时间，同时无任何肝肾毒性作用[23]。目前，索曲妥林已在多个临床试验中使用，主要是作为器官移植后的免疫抑制药或用于肿瘤的治疗。有研究探讨了抑制PKCε对心脏移植成功率的影响，小鼠异位移植模型中注射了PKCε抑制肽(TAT-εV1-2)。结果显示，PKCε活性至少部分参与了同种异体心脏移植后的慢性免疫反应，抑制PKCε活性可为延长移植物存活提供新的治疗策略[24]。

2.3 非典型PKC抑制药 特异性靶向非典型PKC家族蛋白的抑制药较少，其中，报道最广泛的PKCδ抑制药rotlerin已被广泛应用于多种研究中，而Delcasertib(KAI-9803)是一种更具选择性的PKCδ抑制肽。急性心肌梗死大鼠模型研究显示，在缺血后给予KAI-9803可在1 min中内有效进入心肌细胞与心肌内皮细胞，可缩小动物模型缺血/再灌注时的梗死范围，减少心肌细胞和内皮细胞损伤，增强了局部心室功能的恢复，并改善了梗塞区微血管血流，从而减轻缺血再灌注引起的心脏损伤，同时也可迅速从体循环中被清除[25]。文献[26]通过纳入1176例患者，使用Delcasertib 对ST段抬高心肌梗死患者进行直接经皮冠状动脉介入治疗，结果显示，治疗3个月后梗死面积主要疗效终点无显著差异，心电图ST段恢复、ST段稳定恢复时间或左心室射血分数等次要终点方面，均没有发现与治疗相关的显著差异，且临床终点判定(死亡、心力衰竭或严重室性心律失常)的比率无显著差异。

海胆色素A是PKC的抑制药，海胆色素A是从海胆中提取的具有抗氧化、抗菌、抗炎和螯合作用的海洋生物产物，是临床药物组织色素的活性成分，可剂量依赖性地促进心肌细胞分化，使心肌细胞具有更高的搏动频率，促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化[27]，但其具体抑制机制还有待进一步研究。PKCζ抑制药可通过增加内皮NO的释放和抑制中性粒细胞释放的超氧化物，从而减轻中性粒细胞诱导的缺血再灌注后心肌收缩功能障碍。

PKC家族的激酶在心脏中起着至关重要的作用，心肌细胞表达的PKC主要是PKCα，而其他PKC同工酶，如PKCβ、PKCδ、PKCε在健康心脏中也有较低水平的表达，或在病理性心脏重塑过程中诱导表达。。要全面了解它们复杂的心脏特异性信号转导、翻译后修饰的影响、PKC家族内的串扰及其他信号通路及在重塑过程中对心脏生理和基因程序调控的影响，还需要更多的基础和临床研究[28, 29]。