牛钩端螺旋体病的血清学诊断

于 翔

（义县畜牧兽医发展服务中心，辽宁 义县 121100）

牛钩端螺旋体病，简称勾体病，是由病原性钩端螺旋体引起的人畜共患病和自然疫源性传染病。其主要病理特征：急性为暂短的发热、黄疸和血红素尿；亚急性和慢性为进行性消瘦、贫血、流产和皮肤坏死等。本病在全世界都有分布，几乎所有的温血动物都可感染，家畜中的牛感染率较高。因病原体的血清群和血清型较多又十分复杂，临床症状和病理变化也是多种多样，所以依据临床症状和病毒剖检难于确诊，确诊需进行血清学检验。发病初期的病牛血清中含有特异性抗体，采用已知抗原检查对此血清中的抗体进行检验，对于早期的病牛诊断极有价值。

1 凝集溶解定性实验

1.1 材料准备

抗原为本菌多个（14～19个）血清群的标准菌株，分别培养孵育5～7 d的生长良好的培养物，每暗视野含菌体＞50条（400倍），运动活泼而且无自凝现象，便可用作抗原。被检血清按常规办法分离的新鲜血清。

1.2 操作程序

将被检血清以生理盐水作1∶25稀释，加至有机玻璃板的小孔中，每孔加0.1 mL，然后各孔内分别再加标准抗原各0.1 mL。摇匀，置28～30℃温箱内作用3～4 h。由每孔取1滴混合液置玻片上，覆盖盖玻片。在150～200倍暗视野显微镜下观察。同时设生理盐水+抗原的系列对照。

1.3 结果判定

在抗原对照（用生理盐水代替被检血清）无误的情况下，被检血清出现凝溶反应的一孔，即为被检血清含有与该孔的抗原相应的抗体，判为阳性。

2 补体结合实验

患钩体病的病牛，其补体结合性抗体，于病后第3天可出现，第4周达到最高峰，抗体可持续1年，故可用于诊断。本试验操作方法同于常规补体结合试验。但所用抗原是多种株型的混合抗原，虽然具有属特异性，但不能准确定型，一般多用于流行病学调查。被检血清效价＞1∶20才有诊断意义。当恢复血清效价比急性期增高＞4倍时，具有诊断价值。

3 间接免疫荧光实验

本方法检出率高达90%，具有早期诊断的优点。首先根据各地流行的主要菌型制备抗原片，一般用培养5～7 d生长良好的菌液涂片、干燥、火焰固定后，再将用PBS自1∶50、1∶100、1∶200、至1∶400等倍比稀释的4个稀释度灭活被检血清分别滴于抗原涂片处。置37℃湿盒内作用30 min，用pH 7.4 PBS冲洗剩余血清，干后滴加异硫氰酸荧光黄标记的抗体染色30 min，再用PBS冲去游离染色经镜检，如钩体呈明亮的淡绿色荧光则为阳性。效价≥1∶100或双份血清效价增4倍则具有诊断依据。

4 酶联免疫吸附实验

本法特异、敏感，其具体做法是：先将钩体抗体与抗抗体分别按ELISA一般方法提取球蛋白，以辣根过氧化物酶标记，然后按下列方法进行染色检查。

4.1 直接染色法

先将辣根过氧化物酶标记的钩体抗体球蛋白制剂用生理盐水作1∶10稀释后，直接加于用福尔马林固定的钩体涂片，置37℃温盒中染色30～50 min，水洗两次（约5～10 min）空气中干燥后，用联苯胺试剂显影（5%乙二胺四乙酸1 mL，饱和氯化铵1 mL，饱和联苯胺溶液9 mL及3%过氧化氢溶液1滴）4～5 min，水洗，加甘油缓冲液，镜检。

4.2 间接染色法

取福尔马林固定的钩体涂片，先加被检血清，即相应菌型抗体（效价1∶1 000），置37℃湿盒中染色30～50 min，水洗两次后，再加辣根过氧化物酶标记的抗抗体染色30～50 min，洗涤干燥后用联苯胺试剂显影，水洗，加甘油缓冲液，镜检。

上述两种染色法，可见钩体均呈棕黄色，即可判定为阳性。

5 间接红细胞凝集实验

病牛血凝抗体出现较早，具有早期诊断意义。其实验方法和一般间接血凝实验相同。首先提取钩体致敏物质，制备醛化致敏红细胞。然后按下述方法进行试验：血清处理，将被检血清0.1 mL加2.5%正常绵羊红细胞液0.4 mL混匀置于37℃水浴中1 h，但要经常摇动，以吸收正常凝集素。离心沉淀后，再取其上清液即1∶5倍稀释的血清，用生理盐水按倍比稀释成1∶20～1∶640，每个稀释度各取0.8 mL，分别加入两孔（一孔对照），在试验孔内各加2.5%致敏红细胞悬液1滴，而对照孔内则加2.5%正常绵羊红细胞1滴，充分摇匀，置于室温或37℃温箱内2 h观察结果。结果判定：以试验组红细胞有引起“++”凝集的最高血清稀释度作为抗体效价。效价＞1∶160，或双份血清效价增高4倍以上，可作为临床诊断依据。

6 炭抗原凝集实验

按一般炭凝集实验方法，先将钩端螺旋体超声粉碎制成炭抗原，然后将被检血清56℃30 min灭活后，用1%正常兔血清盐水稀释成1∶2～1∶64。各取1滴于玻璃板上。再加炭抗原1滴，摇匀后，于22～37℃静置10 min。结果判定：能引起“++”凝集最高稀释度为效价终点。＞1∶4或双份血清增高＞4倍，判为阳性，但应注意非特异性反应。