基于代谢组学研究艾灸的治疗作用＊

陈丽梅，单 思，张启云，张吉日木吐，刘红宁

（江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 南昌 330004）

1 代谢组学的概念及作用

代谢组学是相对年轻的学科，它涉及有机体和细胞产生的代谢物及化学产物，是基因组和蛋白组相互作用的下游产物，可作为一个敏感的生物表征，正是由于这个特征，代谢组学极大的被用来鉴定疾病的生物标记物和药物的发现。代谢组学主要用于分析生物生理与病理状态或受外界干扰与非干扰条件下内源性小分子代谢物的差异，是系统生物学体系之一。通过数据分析，可以检测出生物体代谢产物的微小变化，获得疾病或治疗的相关信息。与其他生物系统组学相比，代谢组学有其自身的优势：①代谢组学信息合成能力较强，能够反映了最终效应；②代谢物数量有限，研究相对简单。在代谢物水平上，蛋白质和基因表达的微小变化被放大；③技术通用性，即同一个代谢物在所有生物体中都相同[1]。

长期以来，中医药的研究都是按照西医西药的思维，通过植化分离技术得到有效成分后进行研究，这种研究方法并不能完全阐述中药的整体作用。代谢组学将生物体当作一个有机整体进行研究，与中医药的整体性、动态性原则相吻合，其研究方法与思路在中药四气五味、安全性、疾病的诊断及药物作用机制等领域应用越来越广泛。

1.1 代谢组学在中药四气中的研究

中药的四气是在自然界万千变化过程中形成，在前人使用过程中根据其所表现出来的治疗作用总结归纳而成，是指导临床用药原则之一。只有不断超越传统理论，实现理论创新，不断推进中药现代化进程，才能更好地指导临床应用[2]。

中药四气包括寒、凉、温、热四种偏性，这种偏性具有纠正机体寒、热、阴、阳变化。“以热治寒，以寒治热”就是基于中药四气理论指导临床应用。代谢组学从不同性味中药对机体内源性代谢物的变化规律，阐释药性差异及药效物质基础，使中药性味研究现代化。

Kuang[3]等采用超高效液相-质谱联用技术研究寒热中药对大鼠尿液代谢的影响，鉴定出寒性药干预后的生物标记物25个，涉及13个相关的代谢途径，热性药干预后的生物标记物有18个，涉及9个相关的代谢途径，揭示了寒热药物与生物能量代谢的关系。朱明[4]等选择一味热性药和一味寒性药做对比。利用红外成像技术，观察服药后寒热药物在机体内的红外成像，发现热性药物可以提高机体的热辐射和热传导，而寒性药物则相反。苦寒药黄连代谢组学分析结果显示，黄连可通过抑制中枢神经，降低能量代谢[5]。通过文献研读发现，中药性味与机体的能量代谢有密切的联系，这些能量代谢的通路有哪些，引起哪些蛋白发生变化有待进一步研究探讨。

1.2 代谢组学在中药安全性评价中的应用

安全性评价是毒理学术语之一，主要任务是对药物或化学物可能造成接触人群的危害性进行评估。代谢组学技术已经成功的应用与中药安全性评价中。由于产地、采摘时间和加工方法的不同，中药的成分和功效也各不相同，中药处方更是由几种甚至几十种上百种单一中药组成，它们之间相互作用相互影响，其药效和毒性的物质基础是目前亟待解决的问题，这也是限制中医药走向国际化的主要问题所在。为此，荷兰还专门建立了一个中药代谢组学研究中心，用以中药的安全性的评估[6]。

Xu[7]等采用UPLC-Q-TOF∕MS代谢组学技术对补骨脂毒性进行系统评价，血浆代谢组学显示，与补骨脂类化合物毒性相关的潜在标志物有13个，毒性靶器官是肝、肾，其毒性成分是香豆素、补骨脂素代谢物佛手柑内酯和花椒毒素、补骨脂甲素和补骨脂酚[8]。Zhang[9]等采集血清样本进行LC-MS分析，发现半夏的毒性主要与磷脂代谢、氨基酸代谢、左旋肉碱代谢有关，毒性靶器官是心脏。Huo[10]等采用核磁共振的代谢组学方法结合组织病理学和血浆生化分析研究雄黄对小鼠的急、亚慢性肝毒性，其尿液和血浆代谢组学差异提示，雄黄对机体的毒性主要涉及能量代谢、氨基酸代谢和肠道细菌代谢，且急、亚慢性毒性机制相同。

1.3 代谢组学在诊断疾病中的应用

疾病的形成是一个非常复杂的过程，从生理状态到病理状态是由量到质的变化，是身体的自我调节功能在被致病因素损伤后引起异常的生命活动。当致病因素累积到一定程度时，就会引起细胞、组织的损伤，疾病的症状便开始显现出来。疾病的诊断需要通过对表型的分析和病症的追踪而定，如果我们能在疾病的早期阶段捕捉到机体代谢产物的变化，将能更好的帮助了解疾病形成的因素，起到帮助诊断疾病的目的[11-12]。

代谢组学能够定性定量分析组织细胞中所有小分子量代谢物在生理或病理状态下的变化，故此技术已成功应用于各种疾病的诊断，如神经精神障碍[13]、肝纤维化[14]、肝癌[15]、肺癌[16]、肺炎[17]、糖尿病[18]等。同时，代谢组学在高脂血症[19]、动脉粥样硬化[20]、高血压[21]、ACS[22]等心血管疾病中的应用也逐渐引起人们的关注。

1.4 代谢组学在药物作用机制中的应用

生命体在正常状态下，代谢水平处在一个动态平衡中，其在异常或疾病状态下会引起生物体代谢、机能及形态发生异常，想要恢复到生理状态，需在不影响其他正常代谢途径条件下，使代谢网异常部分正常化。通过代谢组学研究由药物引起内源性代谢产物的变化及其代谢途径，有助于阐明药物作用的机理。

Zhang[23]等利用气质联用技术对大鼠肝脏匀浆代谢组学分析，揭示金针菇多糖保护大鼠急性肝损伤功效的潜在作用机制，结果表明，被鉴定为生物标志物的代谢物有16种，金针菇多糖主要通过降低AST和ALT水平，增强抗氧化作用，减少病理损伤，从而保护由CCI4引起的肝损伤。Lang[24]通RP-UPLC-MS与HILIC-UPLC-MS的血浆代谢组学整合策略，探讨桂枝茯苓胶囊对大鼠痛经的整体疗效及干预机制。筛选出20个潜在的生物标志物，主要与能量代谢、鞘脂代谢、类固醇激素生物合成、脂质代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸代谢有关。代谢组学技术能全面获取代谢物信息，深入了解机体生理病理状态，为中医药的科学化开辟新道路。

2 艾灸的作用

艾灸是中医针灸疗法的一部分，它利用艾材燃烧作用于在人体表面，通过药物、光热等作用刺激穴位，预防和治疗疾病[25]。艾灸疗法主要分为直接灸和间接灸，直接灸是将点然的艾材直接放在特定穴位上操作的方式，间接灸是在皮肤上放盐、附子、姜等物质后再进行艾灸的方法。《本草纲目》曰：“艾叶能灸百病”。《医学入门》载：“凡一年四季要各熏一次，之气坚固，百病不生”。中医认为，艾灸具有温经、散寒、扶正、固阳等作用，现代研究对艾灸的作用机制进行了大量的研究，主要包括温热刺激、光辐射、芳香效应及燃烧物灰烬效应等。

2.1 艾灸的温热刺激

灸法是在机体特定穴位进行艾灸治疗疾病的一种方法。《内经》指出“阴阳皆虚，火自当之，陷下则灸之”，说明阴阳气血不足，可用灸法治疗，即灸法具有补阳益气、调节阴阳的作用。气血运行顺畅是正常生命活动的必要条件之一，而正常的气血运行有赖于机体的温煦作用，所谓气温则血滑，气寒则血涩，血见热则行，见寒则凝，故温热刺激对血液的运行有调节作用。艾灸的温热刺激具有以温促通，促进人体气血运行[26-27]。同时，温热刺激能刺激皮肤上多种感受器，影响机体的神经系统功能，当温热刺激接近正常体温时，温度敏感神经纤维只放出频率较低的电，随着温度的升高，温度感受其活动增强，当温热刺激超过机体忍受程度时，温度感受器的活动便会下降甚至停止[28]。

2.1.1 艾灸温热刺激对血液动力学的作用

艾灸能改善特定经络腧穴相应部位的微循环，增大微血管内径，增加血流量、降低血液黏度，加快血流速度[29]。Widmer[30]用导热板局部刺激肌肤，发现毛细血管前括约肌打开时间延长，灌注毛细血管数量增加，局部血流量增加。邱悦[31]对大鼠的足三里进行艾灸后，局部血流灌注量均有提高且呈时间依赖性。灸疗的温热刺激不仅能影响浅表微循环的，还透热、扩热到其他深层组织或器官，可增加胃黏膜[32]、肠系黏膜[33]、大脑动脉[34]、肾血动脉[35]、冠状动脉[36]等内脏血液的微循环。艾灸引起血液流动学变化的作用机制可能与内源性舒张因子、扩血管素及神经调节有关[37]。

2.1.2 艾灸温热刺激对神经系统的作用

艾灸的温热效应能刺激皮肤感受器，激发神经系统功能[38]。大量研究表明，神经系统、内分泌系统和免疫系统之间存在着共同的介导物质，免疫器官可以合成几十种神经递质样物质和激素，具有调控自身神经内分泌和免疫系统的功能[39-44]。在特定穴位进行艾灸，灸热刺激作用于下丘脑前区，使交感和副交感神经兴奋，再通过神经通路影响免疫物质的分泌，发挥免疫调节的功能。下丘脑是主导整个周围自主神经系统的高级中枢，刺激前侧区或尾侧区分别能引起副交感和交感神经兴奋，其中交感神经释放NE和调控肥大细胞释放组胺而发挥直接或间接免疫调节的作用[45]。

2.2 艾灸的光辐射

艾材燃烧时，能谱辐射在0.8μ-5.6μ之间，峰谱在1.5μ附近[46]，说明艾灸辐射能谱不仅具有远红外辐射，还有近红外辐射。近红外波长短，能量强，穿透力强，能穿透机体组织的深度达10 mm左右，约为远红外辐射的10倍[47]。

人体既能向外释放红外辐射，也能不断吸收外部辐射。当外界给予的辐射能与自身辐射能一致或相近时，机体则能接受更多的能量。不同人体和同一人体不同穴位红外辐射绝对光谱及强度差别很大，但归一化处理后光谱具有相当的一致性，说明穴位红外共振辐射可能是灸法治疗作用的基础[48-49]。当人体经穴暴露于近红外光时，细胞内的线粒体、腺苷和三磷酸受到刺激，电子从低级能态跃迁到高级能态，但电子在高级能态存留的时间很短，迅速回到低级能态，同时产生大量的能量，进而激发其他细胞的能量。ATP是人体能量的主要来源，其释放的能量可为已经死亡或接近死亡的细胞提供活化能，使其恢复活力，因此艾材燃烧释放的红外辐射作用特定的穴位能为细胞代谢和免疫功能提供能量。此外，亦可为能量缺乏的病理细胞提供活化能。

机体穴位红外辐射光谱蕴含了大量生理病理信息，与细胞分化、生长、衰亡等一系列生命过程密切相关，反映了组织脏器的代谢变化。在组织光学中，吸收的光子是生物效应的物质基础，机体吸收了光子而产生组织发热效应和化学效应，组织中的蛋白质和色素主要吸收紫外和可见光区，水分子主要吸收红外区。

2.3 艾灸的芳香效应

艾材燃烧释放出具有芳香气味物质，进入机体后具有调节生理和心理的功能，可用于预防、减轻、治疗机体某些疾病。研究发现，芳香物质具有抗炎抗疲劳抗氧化[50]、止痛[51]、止呕[52]、缓解精神压力[53]、改善记忆和情绪[54-55]及降低高血压[56]等作用,在临床上应用越来广泛。《神农本草经百种录》曰：“香者，气之正，正气盛则除邪辟秽也”，说明芳香之气具有扶正驱邪的作用。挥发油具有疏肝理气，辛散走窜的特性，通过皮肤和鼻腔吸入进入经络系统，循经感传达到机体各个脏腑组织，发挥其生物活性，从而调节机体身、心等获得健康。

艾灸的芳香效应与气机运行呈一定的相关性。气味作为药物的偏性，其升降浮沉运动形式与体内之气升降出入相似，以药物之气纠正人体之气，而实现调节盛衰不和的状态。中医认为，无形之气可化生有形之体，气化正常可维持机体正常的生理功能，气机失常则诱发机体运行失常，治疗方法在于调气，疏通气机、恢复阴阳二气合和状态。

2.4 艾灸燃烧灰烬效应

艾燃烧灰烬能粘附在皮肤上，通过经皮渗透进入血液循环，发挥治疗作用。现代研究证实，艾燃烧灰烬具有清除自由基的作用。自由基是含有不成对电子的分子、原子、离子或基团，可以轻易攻击细胞组织种的糖、蛋白质、脂质和其他物质，试图夺得一个电子以达到新的平衡，这样就使得机体内的种种物质发生改变，从而诱发各种疾病和组织损伤[57]。洪宗国等[58]等用甲醇从艾燃烧灰烬中提取了四种不同成分，通过黏度测定发现，四种成分均能为自由基提供电子，使机体组织免受被氧化的功能。

2.5 艾灸的热敏效应

艾灸的热敏现象是陈日新教授在多年的临床灸疗过程中发现的透热、扩热、传热、表面不热深部热、局部不热远部热、非热觉等热敏灸感和经气传导及饱和消敏灸量，并提出了“腧穴敏化”、“辨敏施灸”、“灸之要，气至而有效”三个新概念。腧穴功能有“敏化”和“静息”两种状态，敏化后的腧穴对外界刺激呈现出“小刺激，大反应”，易发动感传，激发经气传导，气至病所，调动机体内在调节潜力，实现对内脏功能的调控，是提高艾灸临床疗效的突破口[59]。

3 代谢组学与艾灸的相关性

艾灸作为中华民族的瑰宝，在临床上应用已有几千年，具有整体性和双向性调节性。近年来，艾灸的基础研究着重在药、热、光等方面，并取得了长足的发展，但其生物学途径和分子机制仍不清晰，特别是在经穴的共性和特性、灸量与效关系等核心问题的研究。代谢组学可以充分显示生物体的生理、病理变化及相关的功能状态，通过对生物体正常状态、病理状态及艾灸治疗后的代谢物变化的检测，有助于解开与疾病相关的代谢物和涉及的相关代谢途径之间的潜在关系，对全面理解复杂系统具有众多潜在的优势。目前来说，检测的代谢物主要有尿液、血液、粪便与各组织，它们的的内源性代谢变化趋势有相同之处也有各自的特性，可以相符补充相符佐证。

3.1 艾灸后血液代谢组的研究

血液是经脾运化水谷精微物质化生而来，包含了各种代谢物质，如糖、蛋白质、脂质等。血清或血浆是代谢学常用的样本，从整体来说，血清和血浆的代谢物种类差别不大，但在收集过程中要保持一致性。She[60]等采用核磁共振代谢组学技术分析正常人艾灸前后血清代谢物的变化及作用机制。结果发现，艾灸组血清中很多内源性代谢物发生变化，包括低密度脂蛋白∕极低密度脂蛋白、异亮氨酸、乳酸、谷氨酰胺、柠檬酸、多不饱和脂肪酸、肌酸、甘氨酸、葡萄糖等。艾灸通过影响代谢物（如支链氨基酸、多不饱和脂肪酸）的浓度来加强机体氨基酸、脂肪酸代谢。在此基础上，钟欢[61]等比较了艾灸和针刺对正常人血清代谢组学的变化，两者表现出一定的差异，艾灸更倾向于对骨骼肌能量代谢、合成代谢的调节。

3.2 艾灸后尿液代谢组的研究

尿液是机体的水液代谢的终产物，包含了来自食物、饮料、环境变化、内源性代谢物和菌群代谢产物等多种代谢分解物，如尿素、有机酸、多种水溶性毒素、氨、尿胆素、无机盐、肌酸酐等。尿液无菌且容易大量获取，不受蛋白质、脂质基其他化合物的干扰，故尿液代谢组深受研究人员关注。为了提高对大家尿液的认识，研究人员对尿液进行了全面定性定量的代谢组学分析。周次利[62]等研究了不同浓度艾灸生成物对正常大鼠的影响，从尿液代谢组学分析中共鉴定出108种差异代谢物，其中高浓度艾灸生成物对大鼠尿液代谢物影响最显著，涉及代谢途径主要有糖、氨基酸代谢，表明艾灸生成能增加正常大鼠的能量代谢、增强机体解毒、抗氧化能力，且其浓度与各种典型代谢物的变化呈现一定正相关。这一点与艾灸及艾生成物对防治AD中的作用一致[63]。

尿液和血液代谢物种类基本相同，但尿液中有超过四百多种代谢物在血液检测中没被报道过，这可能是体液经过肾脏滤过提取后造成代谢物间的差异。

3.3 艾灸后各组织代谢组的研究

在动物实验中，通过解剖比较容易获得组织样品，可用于探索和解释疾病的机制研究。Liu[64]等通过对多个生物样本（血清、胃、大脑皮质和髓质）进行IHNMR代谢组学分析，艾灸通过诱导细胞膜代谢、能量代谢和神经递质功能而产生效果，其主要使通过调节血清和各组织能量代谢。佘畅[65]等用代谢组学技术研究艾灸与针刺对CAG大鼠胃组织代谢物的变化，模型组大鼠胃组织共出现17种代谢物变化，其中7种浓度升高，10种浓度下降，艾灸干预后部分差异性代谢物浓度发生逆转。

4 结论

灸疗法始于原始社会时期，其应用的广泛性和时空性不言而喻，探索其对机体内源性物质代谢的影响及代谢途径，有助于加快灸疗国际化的进程。从代谢组学角度阐明艾灸治疗作用机制有其独特的优点：①艾灸是药、热、光综合因素，通过外部刺激起到某种治疗的作用，利用代谢组学分析艾灸作用的物质基础；②艾灸疗效的关键在于特定经络腧穴，利用代谢组学分析各经穴之间内源性代谢产物差异，阐释经穴特异性，对疾病的治疗及寻找病因有重要的指导意义。

作为一种为自下而上”新的研究思路和方法，代谢组学已广泛应用于中医药多个领域的研究。代谢组学在中医药的现代化进程中起着不可替代的作用，然而由于生物体和外界环境的复杂性，代谢组学的应用仍具有一定局限性。目前，艾灸代谢组学研究仍然处于初级阶段，大部分还是停留在艾灸腧穴后产生的尿液、血液、组织等差异性代谢，而这些差异性代谢只是通过现有的理论进行推测和解释，并未对其作用机制做深入的研究，且样本量少，需要扩大样本量来验证其准确性。在鉴定了差异性代谢物后，需要进一步分析调控这些代谢物的上游蛋白（或通道）和基因。在理清这些机制的基础上，结合艾绒燃烧后自身特性、穴位效应共性与特性以及腧穴之间配伍等关键性问题进行有针对性的研究。应用代谢组学对穴位的配伍规律研究方面大多选简单特定穴位进行研究，但艾灸穴位配伍更应该从临床和实际出发选取，进行实验设计。同时，在艾灸代谢组学研究中，分析技术（NMR或GC-MS或LC-MS）比较单一,而这种单一技术显然不能满足研究需求，因为每种分析技术都有偏倚性，如LC主要检测脂类代谢物，GC-MS主要分析极性较大的小分子代谢物。因此，需要综合两种或两种以上的检测技术，趋利避害，方能更好的了解艾灸对生命体的代谢产物的影响。代谢组学研究代谢物的鉴定软件陆续的被开发出来，处理数据相对简单方便，但由于代谢物具有同质性和低均匀性，导致色谱分析困难，如果能建立一套完善的相关代谢组学数据库，将能得到更准确的分析结果。

代谢组学是发展十分快速的学科，为艾灸相关性研究带来了新的契机，将代谢组学应用于艾灸研究，为艾灸的基础研究提供更科学、更合理的技术，在联合其他系统生物组学（蛋白组学、转录组学、基因组学等），将能更好的全面、系统的解释艾灸作用的内涵，促进艾灸基础理论与临床研究的深入发展。