外泌体与缺血性脑卒中及针灸干预机制＊

李巧凤，彭拥军＊＊，李忠仁，洪 浩，储继红，蔡 云

（1.南京中医药大学附属医院 南京 210029；2.南京中医药大学 南京 210029）

缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS），中医称为“中风”，以猝然昏仆，口舌歪斜，半身不遂，语言不利为主症。IS因脑组织局部供血不足，导致组织缺血缺氧，甚至软化坏死，以神经功能缺损为主要表现。中风致死率仅次于心脏病、癌症、慢性下呼吸道疾病和意外伤害[1]，是发病率、致残率、死亡率较高的疾病。目前IS的治疗最有效的方法为发病后4.5-6个小时内进行溶栓、机械取栓[2]，此方法时间窗较短，很难把握住治疗时机，能够及时接受到有效治疗并改善神经功能的患者极少，且溶栓后的治疗效果可能不佳，患者神经功能缺损的症状仍可能存在，甚至出现其他严重并发症。如何早期诊断、早期治疗是有效改善缺血性脑卒中症状亟需解决的问题。而外泌体作为新型标志物对IS的作用及针灸对外泌体的影响将有助于IS患者的早期诊断、早期治疗。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的形态结构

关于外泌体（exosomes,EXs）的描述最早在1983年，外泌体是一种包含大量细胞表面受体的多种细胞类型产生的复杂“活跃”结构，目前被归类为细胞外囊泡（extracellular vesicles,EV）类的一种，而外泌体尤其是指50-200 nm的微小EV，胞内体内陷形成多囊泡体（multivesicular bodies,MVBS）与细胞膜融合释放出的囊泡即为外泌体，内含蛋白质、营养因子、微小核糖核酸（microRNAs，miRNA）等结构，且因其不被网状内皮组织系统细胞内吞，可通过与靶细胞受体结合，高效运送这些生物信息物质到达靶器官[3]。

外泌体水平转移内容物到靶器官中发挥与所携带的活性物质同样的功效，甚至更好的治疗作用。例如，Manuel等[4]对大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠右股静脉注射间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）及MSC源性外泌体，结果显示了两者的血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）及5-溴脱氧尿核苷（bromodeoxyuridine,Brdu）融合的细胞数量显著增加，二者具有促进血管生成的作用，表明外泌体与其祖细胞具有相似的作用。因此外泌体在介导细胞间通讯中具有重要意义，并且发挥与其来源母细胞相同的功能。

1.2 外泌体的功能

外泌体的功能主要表现在免疫中抗原呈递、损伤组织修复、神经保护、促进髓鞘再生、血管新生等方面[5]。外泌体参与缺血性脑卒中后脑损伤的修复功能[6]，其发挥功效的最大优势是通过血脑屏障不被降解[7]，血脑屏障是血浆和脑脊液间的生理屏障，选择性的转运特定分子，限制98%[8]的小分子物质和几乎所有大分子物质透过血脑屏障，严格控制脑实质与外界细胞间的物质交换，以保持脑组织内环境的基本稳定。

另外，研究证实血液和脑组织的外泌体源性miRNA存在显著相关性，二者随同变化，提示脑组织发生缺血性损伤后血脑屏障被破坏，损伤的脑组织外泌体源性miRNA（exogenous miRNAs,exo-miRNAs）透过血脑屏障释放到循环血液中[9]，因此缺血性脑组织中高表达的exo-miRNAs也存在于血液中，可以反映中枢神经系统状态的信息,为利用血浆外泌体诊治IS提供了临床应用的前提与基础，从而介导大脑对中风后体内微环境进行一系列应答和处理。

2 外泌体有助于IS的诊断

IS的传统诊断主要依据影像学检查，利用血液检验手段诊断IS尚缺少特异性的生物标志物。如何寻找敏感客观的分子指标对IS进行早期准确、安全高效的诊断，是推进IS精准诊断与个体化治疗亟需解决的问题。而外泌体的高灵敏度、稳定性、特异性、高效运送性及易得性的特性恰好是外泌体对脑卒中进行精准诊断的优势所在。近年来，外泌体源性miRNA作为IS的新型诊断标志物得到了越来越多的研究关注。

2.1 miRNA与外泌体源性miRNA的相关性

miRNA是一类生物体内自然生成的长度约21-23 nt的单链非编码核糖核酸（ribose nucleic acid,RNA），具有转录后调控基因表达的功能，作为细胞间通讯的重要介导物质[6]，被认为是组织损伤的敏感血浆生物标志物[10]，近年来发现miR-223[11]、miR-124[12]、miR-9、miR-126、miR-210、miR-221等[13]与缺血性脑卒中有关，且这些miRNA主要聚集于外泌体并且通过外泌体在细胞之间交换[14]，在靶器官内发挥其特定的生物学功能，因此外泌体可以通过水平转移miRNA，介导大脑中的细胞间信号，反应IS的病理状态。由于外泌体是通过选择性的方式分泌到细胞外空间的，因此外泌体miRNA被认为是比血清miRNA更为敏感和具有特异性的生物标志物。

2.2 外泌体miR-223、miR-124、miR-9有望成为IS的特异性诊断标志物

Chen等[15]收集了50名急性缺血性卒中患者在发病初72小时内的血液样本，检测外泌体miR-223和miR-16水平，与健康者相比外泌体miR-16水平相差甚微，而miR-223的含量增加显著，受体工作特征曲线显示当exo-miR-223=-0.50时，曲线下面积为0.859，最佳灵敏度为84.0%，特异性78.8%。且exomiR-223与美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）评分呈正相关，并且观察到预后较差的卒中患者外周血exo-miR-223表达高于有良好预后的卒中患者，提示相比于exomiR-16，exo-miR-223的表达与卒中严重程度和短期预后相关性更大。

外泌体中的miR-124广泛分布在大脑各区域，是大脑中最丰富的miRNA,Ji等[16]采集了65名急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和66名健康者的血清外泌体，与对照组相比，卒中组血清外泌体浓度显著升高，exo-miR-9和exo-miR-124的水平增加与NIHSS评分、梗塞体积和促炎细胞因子白细胞介素-6（interleukin，IL-6）的过度表达呈正相关,且二者曲线下面积分别为0.8026和0.6976，表明血清外泌体miR-9和miR-124是诊断AIS的特异性生物标志物，且miR-9比miR-124具有更高的特异性。

外泌体miR-223、miR-124、miR-9是诊断缺血性脑卒中和评估脑组织损伤程度的潜在生物标志物。

3 外泌体对于IS的治疗作用

外泌体因其来源母细胞不同具有不同的组成成分和功能。多个研究表明外泌体源性miRNA和mRNA网络在介导大脑修复过程中发挥关键作用[17]。Mirzaei等[18]发现中风中组织特异性miRNA中有43个上调，36个下调，其发挥着各自的作用：①神经保护：Let-7，miR-181，miR-200，miR-182，miR-124，miR-134；②髓鞘再生：miR-17-92,miR-145；③促进血管新生：miR-210,miR-222,miR-424,miR-126,miR-130a,miR-378。

3.1 外泌体具有神经保护作用

外泌体在稳定基因组和突触可塑性以及维持与神经发育过程有关的时空梯度方面有一定作用。外泌体可以通过诱导RNA、蛋白质影响缺血性脑重塑过程以发挥神经保护作用。例如，外泌体的miR-124可以促进皮质神经前体细胞在梗塞部位获得神经元表型，从而促进神经保护及修复以改善脑损伤[7]。内皮细胞源性外泌体具有抑制细胞凋亡、促进细胞生长迁移的作用，直接保护神经细胞免受缺血再灌注损伤[19]。

Putz等[20]实验发现泛素连接酶（Neuronal precursor cell developmentally downregulated 4，Nedd4）家族相互作用蛋白1（Family interacting protein 1，Ndfip1）存在于转染的人源胚胎肾细胞293（human emborynic kidney 293T，HEK293T）细胞和未转染的原代皮质神经元的外泌体中，对神经元保护有积极作用，Ndfip1还可作为外泌体内膜结合蛋白转运至细胞外环境，在神经元损伤期间，大量有害物质在神经元内外积聚，诱导细胞死亡，Ndfip1的表达增加导致外泌体中泛素化蛋白的积累，从而高效隔离和去除毒性物质，改善神经元存活。

MSC是能够促进血管新生的多向分化性成体干细胞[21],被称作“药物信号细胞”[22]。MSC释放的外泌体中的miR-133b下调结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor，CTGF）表达和大鼠肉瘤同源基因家族A（rat sarcoma homolog gene family member A,RhoA）蛋白表达，前者被认为是轴突再生障碍的一个因子，后者为影响神经元形态发育的关键调节因子并且可影响神经突的可塑性，改善MCAO大鼠的中风症状[23]。

3.2 外泌体发挥髓鞘再生作用

Xin等[24]对MCAO大鼠静脉注射大量的Exo-miR-17-92，激活亚型3-激酶∕蛋白激酶B∕亚型靶蛋白信号通路（Phosphatidylinositol 3-hydroxykinase∕protein kinase∕mammalian target of rapamycin,PI3K∕Akt∕mTOR），该通路是调节细胞增殖、生长、分化、生存的重要通路[25]，以使糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）失活，GSK-3β在成人脑内广泛表达，参与细胞的增殖、迁移、分化、神经母细胞和神经元的可塑性[26]，脑梗时该通路被抑制，Exo-miR-17-92激活该通路，使PI3K-AKT通过mTOR途径促进轴突局部蛋白质的合成，使GSK-3β的失活，促进了中枢神经系统的髓鞘再生。

Pusic等[27]将干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）诱导下的树突细胞（dendritic cells，DC）外泌体经鼻给药，在被少突胶质细胞摄取后，发现参与少突胶质细胞分化和抗炎途径的特异性miRNA在IFNγ-DC-Exos中高度表 达，特 别 是miR-219、miR-181a，miR-451，miR-532-5p和miR-665高度集中，结果证实FNγ-DC-Exos可以有效增加脑髓鞘的形成和氧化耐受，促进急性脱髓鞘后的髓鞘再生。

另外，雪旺细胞通过分泌外泌体的形式促进P75神经营养因子受体（P75 neurotrophic receptor,P75NTR）分泌，从而促进轴突再生。雪旺细胞是神经胶质细胞，p75NTR属于I型跨膜糖蛋白，能与众多神经营养因子及神经营养因子前体结合。雪旺细胞外泌体中富含p75NTR，通过拮抗神经突生长抑制因子受体（Neurite outgrowth inhibitor receptor，NgR）信号通路使抑制分子的分泌减少，促进轴突再生[28]。

3.3 外泌体促进血管新生

血管新生是外泌体众多作用中至为重要的一个作用，血管新生即从现有的血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）增殖、迁移至微血管床上，产生新的血管，以便向各种器官和组织提供营养物质和氧气，它既是正常的生理过程，也是应对神经系统疾病的一种自然防御反应[29]。重建功能性脑微血管网络将改善局部血液供应并促进中风恢复。

外泌体的促血管再生机制可能与下列因素有关：①缺 氧 诱 导 因 子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）缺氧条件下过表达供体使外泌体分泌能力增强；②外泌体通过激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）∕Akt信号活化血管内皮细胞，血管内皮细胞分泌细胞外基质和血管再生因子，增强表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的表达和激活ERK1∕2信号通路，促进局部血管形成；③具有促血管生成功能的microRNA在缺血环境下在外泌体中高表达提高血管生成能力；④Notch的主要配体Jagged1诱导血管再生；⑤NO释放聚合物可以促进外泌体的促血管生成成分，增强血管生成作用[30]。HIF-VEGF-Notch信号通路贯穿血管新生过程的始终，在外泌体发挥血管生成作用中起到重要作用。

miRNAs是血管生成的关键调节因子，外泌体通过转载miRNA激活PI3K∕Akt信号通路，增加脑血管周细胞内皮生长因子（VEGF）的miRNA和蛋白质水平导致血管生成，在VEGF的诱导下进一步激活Notch信号传导通路，以使血管屏障能够保持完整性[31]，例如MSC-EXs中miR-132-3p作为一种具有血管再生作用的特异性miRNA，其在缺氧∕复氧诱导下表达上调，激活PI3K∕Akt信号通路，修复受损脑血管内皮细胞的血管再生、增殖、迁移能力及Akt磷酸化水平，内皮细胞诱导毛细血管网络结构[32]，表明外泌体有助于观察中风后脑修复过程中神经发生和血管生成的耦合，促进中风后的功能恢复。

此外，局灶性脑缺血小鼠模型中脑血管的miRNA-15a的下调能够增加VEGF，促进梗死周围区的血管生成并且诱导VEGF与神经前体细胞中的VEGFR2相互作用，改善神经组织结构，促进血管增殖和神经元分化[23]。Horie等[33]通过人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的体外血管生成测定揭示了碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9,CA9）外泌体具有促进血管迁移和形成的作用，在缺氧刺激下激活HIF1，分泌缺氧诱导基因CA9，上调基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）表达，MMP2是一种促血管生长因子，外泌体高表达MMP2,增强血管生成作用，提供营养物质和氧气，维持细胞存活。

血管生成的程度通常与脑梗塞减少和神经恢复改善密切相关，因此，促进缺血后血管生成是临床环境中治疗急性缺血性中风的重要治疗策略。外泌体发挥促血管作用的机制可能是通过调节HIF-VEGFNotch信号通路表达，外泌体miRNA可能参与调控该通路来促进血管新生。

4 针灸对外泌体的影响有助于探究针灸治疗IS的新机制

目前针灸治疗IS的机制主要认为通过扩张血管、改善血液流变性，增加侧支循环，改善脑部血液供应，降低血液黏稠度，促进环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）分泌，降低一氧化氮的神经毒性，抑制细胞的调亡，减轻自由基损伤和脂质过氧化反应，控制钙超载等机制进行干预治疗[34]。针灸对外泌体的影响将有助于进一步研究针灸的脑保护机制，并且将针灸治疗精准化便捷化，从而指导针灸临床实践。

针刺刺激肥大细胞释放出外泌体，外泌体能够刺激淋巴细胞，增强针刺免疫调节的效果，且肥大细胞多集中于穴位，主要分布在毛细血管和周围神经，在针刺反应下，肥大细胞沿神经传递信息，兴奋局部传入神经，外泌体也能刺激神经末梢释放肽物质（substance p,SP），反馈到肥大细胞，进一步刺激肥大细胞释放免疫活性物质，促进针刺局部位点的神经免疫调节[35]，这是导致针灸有效性的关键因素之一。

Su等[36]对经针刺结合低频电刺激和未予刺激的小鼠血清中的外泌体进行了miRNAs测序，发现34种microRNAs发生改变，其中miR-181d-5p的含量增加明显，而它可以作用于瞬时受体电位离子通道蛋白7抗体（transient receptor potential melastain 7,TRPM7）[37]，TRPM7在神经系统分布广泛，是一种双功能蛋白，具有阳离子通道和蛋白激酶双重结构，与血管损伤的关系密切，脑组织在缺血缺氧情况下，钙离子大量内流，导致细胞内钙超载，导致神经元兴奋毒性，TRPM7对钙镁等阳离子具有较高渗透性，维持细胞内阳离子稳态，通过调节钙镁离子的平衡而达到保护神经元的作用[38]。针刺促进外泌体分泌激发TRPM7，促进氧糖剥夺后脑微血管内皮细胞的迁移和血管生成，对IS患者的脑部血液供应及神经元保护具有重要作用。

Liu等[39]用电针刺激曲池和足三里，发现电针（electric acupuncture,EA）组梗死周围皮质中miR-9的表达增加，核因子kB（Nuclear factor kappa beta,NFkB）信号通路相关因子NF-kBp65，肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α和IL-1β减少。NF-kB是最重要的核转录因子之一[40]，当脑梗死发生时NFkB抑制蛋白（inhibitor of NF-kB,IkB）可被IkB激酶磷酸化激活，NF-kB活化移位，部分脑细胞发生异常变化，导致下游多种促炎细胞因子分泌，损伤动脉血管内皮，脑组织血流灌注减少，缺血缺氧程度加重，最终导致脑血管闭塞。电针可以调节miR-9介导的NFkB信号传导途径并减少促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，改善脑卒中患者的脑血流灌注。

另外，电针还可以通过下调miR-449a表达促进神经干细胞的增殖和神经元的存活，miR-449在脑梗死患者的血清中较健康者的水平高，miR-499和血清C反应蛋白呈正相关，并且能够促进神经干细胞生物标志物巢蛋白、神经元特异性核蛋白、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）的表达显着增加，前者作为成熟神经元的特异性标志物，后者与神经再生密切相关[41]，电针刺激减少miR-449的表达，有助于受损脑神经的恢复。

因此电针可以促进作为细胞间通信介质的外泌体的分泌，在治疗过程中起积极作用，以调节外泌体所携带的活性因子、miRNA等物质数量表达的方式，有效改善IS的临床症状。

5 小结与展望

外泌体因其具有穿过血脑屏障的独特性以及分布广泛的特点在IS的应用中具有极大潜能，对脑组织损伤具有神经保护及修复、促进髓鞘再生、血管新生等作用，但目前关于外泌体的研究大多局限在miRNA领域，其他外泌体分泌物研究较少，关于外泌体中各种生物活性物质的相互作用及靶向运输的通路调控机制及高精度的外泌体分离提纯的方式还不完善，而针灸因其稳定性、安全性、简便性被广泛应用于IS的治疗中，它对于外泌体活性物质有调节作用，然而具体机制尚不清楚，相关实验文献较少。电针对于外泌体的作用与特定穴位之间的关联也有待考究。进一步开展有关实验，有助于研究电针对外泌体的影响，从而指导针灸临床实践。